酶－抗酶复合物(PAP)的制备

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1．取单价特异性抗酶血清10ml，1.5×104r/min(4℃)离心20min，吸取上清。

2．于上清液中滴加酶溶液(0.5mg/ml)直至不再产生沉淀,静置1h，1.5×104r/min离心20min。

3．将沉淀物用冷生理盐水125ml洗三次，每次1.5×104r/min离心20min。

4．于冰浴下，将沉淀物悬混于4ml HRP(2mg/ml)中。

5．在pH计监测下，边搅拌边加0.1Mol/L或0.01Mol/L HCl至pH 2.3。此时沉淀已全部溶解，1.5×104r/min离心20min。

6．吸取上清，用0.1Mol/L NaOH调pH至7.4。

7．量体积，加入1/10容量的0.075Mol/L醋酸钠和0.15Mol/L醋酸铵的等量混合液。

8．逐滴加入等体积的100%饱和硫酸铵，搅拌20min。1.5×104r/min离心20min。

9．将沉淀物用50%饱和硫酸铵洗1次，同样离心。

10．将沉淀物悬混于5ml蒸馏水中，以pH6.75缓冲盐水透析3天，每天换水1次。(缓冲盐水由1.35×104ml生理盐水, 25ml 1.5Mol/L醋酸钠和75ml 2Mol/L醋酸铵配成)。

11．1.5×104r/min(4℃)离心20min，吸取上清，于OD280nm和OD403nm测定,计算IgG和酶含量及克分子 比值。
12．按0.1ml分装，-20℃保存。

13．应用时从低温冰箱 中取出,立即在37℃水浴中融化。