免疫酶染色卵白素-生物素-酶复合物染色法

最新修订时间：2022-02-10

简介

免疫酶染色卵白素-生物素-酶复合物染色法，也称 ABC 法，是常用的标记和检测系统，也可以应用于免疫细胞化学技术。

原理

免疫酶染色卵白素-生物素-酶复合物染色法的基本原理是生物素化的一抗检测细胞表达的抗原，再加入酶或荧光素标记的链霉亲和素或亲和素进行检测。

材料与仪器

器材：12 孔培养板、培养箱、盖玻片、移液器。

试剂：

① 培养液:10%FCS-RPMI 1640 培养液;

② 鼠抗激活素 IIA 型单克隆抗体；

③ 生物素标记的羊抗鼠 IgG 抗体；

④ ABC 复合物；

⑤ 4% 多聚甲醛、DAB 显色缓冲液、PBS 溶液、1% BSA。

步骤

免疫酶染色卵白素-生物素-酶复合物染色法的基本过程可分为如下几步：（本实验以间接 ABC 法检测小鼠巨噬细胞激活素 IIA 型受体表达为例，实验采用鼠抗激活素 IIA 抗体作为一抗，生物素标记的羊抗鼠 IgG 抗体作为二抗，用酶标亲和素显示抗原抗体结合。）

A. 无菌条件下取小鼠腹腔巨噬细胞，用培养液 10%FCS-RPMI 1640 调细胞浓度至 1x10⁵/ml。

B. 无菌盖玻片，放在 12 孔培养液中，每孔加入巨噬细胞悬液 1 ml，37℃、5%CO₂ 培养 24 小时。

C. 取出盖玻片，经 1xPBS 漂洗 3 次，用 4% 多聚甲醛固定 10-30 分钟。

D. 采用 1% BSA 室温封闭 30 分钟。

E. 加入 50μl 鼠抗激活素 IIA 型 IgG 抗体（1:600 稀释），室温反应 60 分钟。

F.1xPBS 漂洗 3-4 次。

G. 加入 50μl 生物素标记的羊抗鼠 IgG 抗体，室温避光反应 60 分钟。

H.1xPBS 漂洗 3-4 次。

I. 加入 1 滴 ABC 复合物，反应 20 分钟。

J.1xPBS 漂洗 3-4 次。

K. 加入 DAB 显色缓冲液，显微镜下观察显色 5 分钟。

L.1xPBS 漂洗，终止反应，脱水，封片，显微镜下观察结果。

来源：丁香实验