简介
免疫酶染色碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色法，也称 APAAP 法，是一种间接免疫染色的衍生技术。
原理
免疫酶染色碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色法的基本原理是 APAAP 复合物是碱性磷酸酶（AP）与抗碱性磷酸酶抗体（AAP）结合而成的免疫复合物，作为显示检测抗体（一抗）的标记物。APAAP 法要求检测抗体（一抗）与抗碱性磷酸酶抗体（AAP）具有相同的 Fc 段，例如均为鼠 IgG 抗体。用兔抗鼠 IgG 抗体（二抗）起搭桥作用，其中一个 Fab 段与一抗结合，另一个 Fab 段连接 APAAP 复合物中的 AAP 结合，通过 APAAP 复合物中的 AP 催化底物显色来对抗原分子进行定性和定位。图解示意【4-5】。
材料与仪器
器材：普通光学显微镜、蜡笔、湿盒。
试剂：
① 一抗: 单克隆抗体（鼠 IgG），兔抗鼠 IgG 抗体（二抗）；
② 抗体稀释用含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBS ；
③ APAAP 复合物；
④ 碱性磷酸酶（AP）底物溶液:3 mg 对硝基磷酸盐（PNP）溶于 5 ml 10% 二乙醇胺缓冲液（9.7 ml 二乙醇胺，10 mg MgCl2·6 H20,20 mg NaN3 溶于蒸馏水），以 1mol/L HCl 校正为 pH9.8，加水至 100 ml，4℃ 保存
⑤ TBS 缓冲液（0.05mol/L Tris-HCl，pH7.6）: 30.25 g Tris，40.0 g NaCl，11 ml HCL，加蒸馏水至 500 ml，调 pH 值至 7.6；
⑥ Mayer 苏木精复染液:0.1 g 苏木精，5 g 钾明矾，0.1 g 柠檬酸，5 g 水合氯醛，0.02 g 碘酸钠，100 ml 蒸馏水。将苏木精、钾明矾和碘酸钠溶于蒸馏水，再加温搅拌溶解，加柠檬酸和水合氯醛，混合后煮沸 5 分钟，冷却后过滤备用；
⑦ 丙酮；
⑧ 坚固红。
步骤
免疫酶染色碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色法的基本过程可分为如下几步：
A. 取细胞爬片或甩片。
B. 丙酮固定 5 分钟，空气中干燥 10 分钟，TBS 浸洗 5 分钟；取出玻片仔细擦干，用蜡笔在细胞周围划一圆圈，加入的溶液不要流出该圈。
C. 在圆圈内滴加 20-50μl 第一抗体，放湿盒内 37℃ 温育 1 小时或 4℃ 过夜，TBS 浸洗 5 分钟，吸干。
D. 滴加 10-50μl 二抗，放湿盒内 37℃ 温育 30-60 分钟，TBS 浸洗 5 分钟，吸干。
E. 滴加 10-50μl APAAP 复合物，放湿盒内 37℃，30-60 分钟，TBS 浸洗 5 分钟，吸干。
F. 滴加 10-50μl 底物显色液（临用前配制，取底物溶液 1 ml 加坚固红 1 mg，充分溶解后使用），放湿盒内 37℃ 温育 30 分钟，TBS 浸洗 5 分钟；擦干蜡笔圈外的水分。
G. 加 Mayer 苏木精复染 1 分钟，用自来水冲洗，空气中干燥。
H. 高倍镜下观察: 以细胞膜上或细胞质着红色为阳性细胞，无色者为阴性细胞，并计算阳性细胞百分率。
来源：丁香实验
