酶-抗酶复合物的制备

1970年Sternberger等首先报道PAP法，也称为非标记抗体酶法（unlabelled antibody enzyme method）。此法不用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反应的改变和损伤，从而可使免疫酶法的灵敏度大为提高，常用于ELISA和免疫组织化学染色。

PAP制备的基本原理：抗体与相应抗原在一定条件下发生沉淀反应，但当抗原过量时，则形成可溶性抗原抗体复合物。由于HRP和抗HRP之间的反应主要依靠非离子力、范德华力和氢键，故HRP-抗HRP复合物不易溶解。但对HRP-抗HRP复合物酸化时，离子间的相互作用变弱，在这种情况下，加入少量过量的HRP，即可形成可溶性HRP-抗HRP复合物（PAP）。

[附注1] HRP与抗HRP的等价带的选择

1. 用生理盐水配制0.05mg/ml、0.1mg/m、0.15mg/ml…至3 mg/ml的HRP溶液；

2. 各稀释度HRP 0.2ml/管，分别加抗HRP血清0.2ml，混匀，4℃过夜；

3. 5000r/min离心30min；

4. 各取0.15ml上清分别加到对应的第2和第3支空试管中，然后往第2支试管中加0.1ml抗HRP，往第3支试管中加0.1mg/ml HRP 0.1ml；

5. 混匀，在室温放1h后观察。如第2支试管中产生沉淀，说明其对应的第1支反应管中抗原过量；如第2支试管中不产生沉淀，而第3支试管中产生沉淀，说明其对应的第1支反应管中抗体过量；

6. 制备PAP时，HRP的浓度应选取抗原过量管的前一管。

[附注2] 兔（或羊）抗HRP的制备

1. 兔抗HRP的制备：取HRP1mg溶于生理盐水中，加弗氏完全佐剂1ml充分乳化后注射于兔足掌、颈部和背部皮下，10后每隔1周于皮下、腹股沟淋巴结周围注射不加佐剂的0.5mg HRP，连续3次后试血.待琼脂双向扩散效价(对1mg/mlHRP)达1：8以上，即可放血.

2. 羊抗HRP的制备： 25Kg绵羊一只。取HRP 8mg溶于生理盐水中，加弗氏完全佐剂1ml充分乳化后注射于四肢和2处皮下，半月后重复一次。再两周后注射不加佐剂的8mg HRP，一周后放血。

[PAP的质量鉴定]

1. 采用双向免疫扩散法，PAP复合物应对羊抗兔及兔抗HRP均能形成免疫沉淀线，抗体效价应大于1：16（稀释抗体）。

2. 酶量和IgG量

酶量（mg/ml）=OD403 ′0.4′稀释倍数

IgG量（mg/ml）=[（OD280- OD403 ）′ OD280 ′0.62]÷OD403

3. HRP/抗HRP IgG克分子比值：约为2.0。