原理
在核内，RNA 聚合酶 Ⅱ 的转录产物同大量不同类型的核前体 mRNA/mRNA 结合蛋白，不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucUoprotein，hnRNP) 结合形成 hnRNP 复合物。
材料与仪器
HeLa S3 细胞 抗体
免疫纯化缓冲液
蛋白 A-Sepharose 凝胶 单向凝胶电泳 双向非平衡 pH 凝胶电泳
免疫纯化缓冲液
蛋白 A-Sepharose 凝胶 单向凝胶电泳 双向非平衡 pH 凝胶电泳
步骤
一、材料与设备
1. 细胞与代谢标记蛋白质
(1) HeLa S3 细胞的培养：含有 10% HeLa S3 细胞和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基。
(2) HeLa S3 细胞标记：无甲硫氨酸和胱氨酸的 DMEM，10% DMEM，5% 胎牛血清 ( FCS )，1% 青霉素/链霉素，20 μCi/ml TRANS ( ICN，COSTAMESA，CA，USA )。
2. 抗体和蛋白 A-Sepharose 凝胶
(1) 抗体：任何对特定的 hnRNP 蛋白有特异性并有高亲和力的单克隆抗体都可以用作免疫亲和纯化。成功应用的单克隆抗体有4B10 ( 抗 hnRNP A1)、4F4 ( 抗 hnRNP C1/C2 ) 和 4D11 ( 抗 hnRNP)。
(2) 蛋白 A-Sepharose ( pharmacyia Biotech，Piscataway，NJ.USA）。
3. 免疫纯化缓冲液
(1) 免疫纯化缓冲液 1 ( IPB1 )：RSB-100 [ 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，100 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L MgCl2 ]，0.5% Triton X-100，1 μg/ml 亮抑酶肽 ( leupetin )，1 μg/ml 胃酶抑制剂（peppstatin )，0.5% ( V/V ) 抑蛋白酶肽（aprotinin )。
(2) 免疫纯化缓冲液 2 ( IPB2 )：除了没有 Triton X-100 外，其余成分同 IPB1。
(3) 免疫纯化缓冲液 3 ( IPB3 )：PBS，1 mmol/L EDTA，1% 二甲基甜菜碱（Empigen BB )，0.1 mmol/L DTT。
(4) 免疫纯化缓冲液 4 ( IPB4 )：PBS，1 mmol/L EDTA，1% Triton X-100，0.5% 去氧胆酸，0.1% SDS，0.5% 抑蛋白酶肽。IPB4 可配制 5X 的储存液，在 4℃ 保存不超过一个月。
4. 单向凝胶电泳
(1) 试剂：10% ( m/V ) SDS ( 高压灭菌后室温保存 )；3% ( m/V ) 过硫酸铵（APS )，1 ml 每份， -20℃ 保存；TEMED。
(2) 分离胶用丙烯酰胺储存液：167.5 g（33.5%）丙烯酰胺和 1.5 g（0.3%）甲叉双丙烯酰胺溶于 45 ml 水中，搅拌直至完全溶解，加水至 500 ml，用 Whatman 1 号滤纸过滤。在棕色瓶中于 4℃ 可保存至少 2 个月。
(3) 分离胶缓冲液：1 mol/L Tris-HCl ( pH 9.1）。4℃ 至少可保存 3 个月。
(4) 浓缩胶用丙烯酰胺储存液：60 g（30%）丙烯酰胺和 0.88 g（0.44%）甲叉双丙烯酰胺溶于 175 ml 水中，搅拌直至完全溶解，补充水至 200 ml，用 Whaman 1 号滤纸过滤。在棕色瓶中于 4°C 可保存至少 2 个月。
(5) 浓缩胶缓冲液：0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8 )。4℃ 保存至少 3 个月。
(6) 2X 上样缓冲液：5 ml 0.5 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8)，8 ml 10% SDS，4 ml 重蒸馏甘油，2 ml β-巯基乙醇，2 mg 溴酚蓝，加水补充到 20 ml。-20°C 保存至少 4 个月。
(7) 4X 电泳缓冲液：96 g Tris 碱，460.8 g 甘氨酸，32 g SDS 溶于适量水中，最终补充到 8 L。室温避光保存。
(8) 设备：垂直凝胶电泳装置。
5. 双向非平衡 pH 凝胶电泳
(1) 试剂：超纯尿素；10% NP-40；40% Bin-Lyte 3/10 两性电解质（Bio-Rad公司）； 10% APS；TEMEI）。
(2) 等电聚焦（isofocusing ) 丙烯酰胺储存液：28.38 g 丙烯酰胺和 1.62 g 甲叉双丙烯酰胺溶于 90 ml 水中，搅拌至完全溶解，补充水至 100 ml。用 Whatman 1 号滤纸过滤，在棕色瓶中可保存 3 个月。
(3) 上槽缓冲液 ( 0.01 mol/L 磷酸）：1 ml 85% 的磷酸溶于 470 ml 水中。
(4) 下槽缓冲液（0.02 mol/L NaOH）：12 ml 1 mol/L NaOH 加入 600 ml 水中并用真空泵脱气 5 min。
(5) 样品缓冲液：1.43 g 超纯尿素，0.5 ml 10% Nonidet P-40，0.125 ml 40% ampholines，加水至 2.93 ml。分成 100 μl 每份，-70℃ 可保存 1 年。
(6) 95% 样品挤出缓冲液：混合 12.7 ml 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8 )，8 ml 甘油，10 ml 0.1% 溴酚蓝，20 ml 10% SDS，用水补充至 95 ml，室温保存。用前立即加 β-巯基乙醇至终浓度为 5%。
(7) 其他装置：管状凝胶电泳装置，垂直凝胶电泳装置，试管架，结核菌素注射器。
二、操作方法
1. 核质的制备
(1) HeLa 细胞培养至大部分发生融合，采用 [ 35S ] 甲硫氨酸进行蛋白质标记，倾去培养液后用无菌 PBS 冼涤一次，每 10 cm 培养皿加 5 ml 细胞标记培养基，培养过夜（8~12 h）。下面所有操作都采用 1.5 ml 离心管在 4°C 进行，每次亲和纯化约需半皿细胞。
(2) 每 10 cm 培养皿用 5 ml PBS 洗两次，加入 1.5 ml IPB1 后，用细胞刮刀彻底刮下细胞。用与注射器相连的 25 号针头吹打细胞悬液 4 次，操作时避免起泡沫。
(3) 3000 g 离心裂解液 3 min。
(4) 用 0.5 ml IPB2 重悬 XL 胞核沉淀，冰浴中超声 3 次，两次之间间隔 15 秒。
(5) 取 0.5 ml 30% 蔗糖 ( 用 IPB2 配制）加至离心管中，将超声后的溶液轻轻铺在蔗糖溶液表面，于 4800 g 离心 15 min。
(6) 移出在蔗糖液之上的核质部分（约 0.5 ml），加入 Triton X-100 至终浓度为 0.5%。
2. hnRNP 复合物的免疫纯化和凝胶分析
本方法是用抗 hnRNP 的单克隆抗体纯化 hnRNP 复合物。免疫纯化在非离子型去污剂条件下进行以避免破坏蛋白-蛋白和蛋白-RNA 相互作用。操作应迅速以最大程度降低核酸酶的作用，单克隆抗体预先结合在蛋白 A Sepharose 颗粒上，与核质的孵育不超 过 15 min。
(1) 所有步骤均在 4℃ 操作。加 1 ml IPB1 至离心管中，再加 1~5 μl 腹水，3 μl 兔抗鼠 IgG，50 μl 蛋白 A-Scpharose（50%，用PBS 配制混合后，置于混合器上于 4℃ 反应 1 h。
(2) 用 1 ml lPB1 涡旋振荡洗涤 3 次，离心 3 s，弃上清。
(3) 在每管含约 25 μl 结合抗体的蛋白 A-Sepharose 颗粒中加 250 μl 标记的核质，在 4℃ 混合 15 min。
(4) Sepharose 凝胶颗粒用 IPB1 洗 5 次，每次 1 ml，然后用 1 ml RSB-100 洗一次。
(5) 用配有 27 号针头的注射器除去过剩的液体，但不能使蛋白 A-Sepharose 干燥时间过长。
(6) 采用单向凝胶电泳进行分析，加 40 μl 2X 电泳上样缓冲液，100℃ 加热 3 min，微量离心机上最大转速离心 2 min，每个泳道上样 20 μl。
(7) 采用双向凝胶电泳分析，加 20 μl 同样的缓冲液和 2μl 20 mmol/L DTT。混合并在室温孵育 5 min。离心 30 s，上清再离心30 s。每个泳道上样 18~20 μl。按操作5 “双向凝胶电泳” 步骤 (1)~(5) 的方法电泳。
2. 特定 hnRNP 蛋白的免疫纯化和凝胶分析
通过免疫亲和纯化仅被单克隆抗体特异性识別的蛋白质 ( 特别是此蛋白不是已知的 hnRNP 复合体的成分时 ) 非常有用，可以采用以下两种方法，从标记的细胞提取物中直接免疫纯化或从纯化的 hnRNP 复合物中纯化。下面分别加以介绍：
(1) 从标记的细胞提取物中纯化。前面的步骤同操作1 “核质的制备” 中的步骤(1) 和(2)，但用 IPB3 或 IPB1 代替 IPB1 重悬细胞核沉淀，然后直接超声细胞裂解物 [ 操作1 “核质的制备” 中的步骤 (4) ] 。在离心管中以最大转速离心 10 min 去除沉淀，然后按操作2 “hnRNP 复合物的免疫纯化和凝胶分析” 的方法进行免疫纯化（用 IPB3 或 IPB4 代替 IPB1 )。
(2) 从免疫纯化的 hnRNP 中进行免疫纯化。按操作1 “hnRNP 复合物的免疫纯化和凝胶分析” 步骤(1)~(5) 的方法纯化 hnRNP 复合物。加 50~100 μl 含 1% SDS 的 RSB-100 并于 100℃ 加热 3 min 以解离复合物，然后冷却到室温，加 IPB4 稀释 10 倍（使 SDS 浓度降到约 0.1%）。最后按操作2 “hnRNP 复合物的免疫纯化和凝胶分析” 的方法纯化蛋白（用 IPB4 代替 IPB1 )。
4. 单向凝胶电泳
本实验中采用的不连续缓冲凝胶系统对低分子质暈和高分子质量的 hnRNP 均有较好的分辨率，且在真空凝胶干燥器中干燥时不易破裂。
(1) 12.5% 分离胶的配制。将 14.8 ml 分离胶用丙烯酰胺储存液、15.2 ml 电泳缓冲液、8.3 ml 水、0.4 ml 10% SDS、1 ml 3% 过硫酸铵（APS) 和 20 μ TEMED 混合。在电泳装置中灌制凝胶，上层以 0.1% SDS 覆盖，待其聚合。
(2) 浓缩胶的配制。将 1.3 ml 浓缩胶用丙烯酰胺储存液、2.5 ml 0.5 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8)、6.1 ml 水、0.1 ml 10% SDS、0.1 ml 过硫酸铵（APS ) 和 25 μl TEMED 混合。在聚合的分离胶上灌制约 1 cm 高的浓缩胶，插上梳子。
(3) 使用 Hoefcr SE400 凝胶电泳装置，20 μl 蛋白样品先采用 80 伏电压电泳使其浓缩，然后以 150V 电压电泳约 5 h，直至溴酚蓝完全泳出凝胶。
(4) 固定，染色。凝胶在 10% 乙酸、25% 异丙醇和 0.025% ( m/V ) 考马斯亮蓝中固定、染色过夜，然后用 10% 乙酸脱色 2 h。
(5) 显影。凝胶在 DMSO 中浸泡 15 min，倒掉 DMSO 并加入新的 DMSO 再浸泡 15 min。倒掉 DMSO，再加入含 22% 2，5-二苯恶唑（PPO ) 的 DMSO 浸泡 1 h，再倒掉，然后以流水洗 1 h。用加热真空凝胶干燥器干燥 1.5 h。
5. 双向凝胶电泳
因为 hnRNP 复合物由大量的蛋白质构成，所以采用双向电泳进行分析更能反映这些复合物的复杂性。由于人 hnRNP 复合物中含有大量的碱性蛋白，因此采用不平衡 pH 凝胶电泳进行第一向电泳。
(1) 第一向凝胶的制备。在一个放有搅拌子的 10 ml 烧杯中加入 1.38 g 超纯尿素、0.5 ml 10% NP40、125 μl 40% 两性电解质、0.49 ml 水，0.33 ml 等电聚焦丙烯酰胺储存液，这足够灌制 9 管凝胶。以封口膜盖住烧杯，搅拌混合 30 min 直至尿素完全溶解。不要加热丙烯酰胺溶液。
(2) 在混合丙烯酰胺溶液时，将制作模型用黏土平铺在干净的工作台上并用封口膜覆盖。将两根橡皮筋绕在试管架的外围并将试管架压入黏土中，同时在结核菌素注射器的前端加上一个 200 μl 的毛细管（离底部 11.5 cm 处作一记号）。
(3) 准备好凝胶溶液后，加入 4 μl 10% APS 和 5 μl TEMED，混匀，用注射器吸入丙烯酰胺溶液至液面刚过 11.5 cm 记号处。然后将毛细管通过固定在试管架外围的橡皮筋并固定在底端的黏土上，调整液面至刚刚为 5 cm 记号处，并检査是否有气泡。
(4) 所有凝胶灌注好后，在每个凝胶顶部覆盖 15 μl 8 mol/L 的尿素，并用封口膜盖住。聚合 4 h。
(5) 凝胶。聚合好后，去掉覆盖的尿素。选用等长的凝胶。
(6) 在管状凝胶装置的下槽加入脱过气的 NaOH 溶液。
(7) 用一个带 21 号弯曲针头的注射器吸掉胶管底部的气泡。
(8) 把胶管插入带橡胶接头的管架中，把管架放在下槽，上槽充满 0.01 mol/L 磷酸溶液。
(9) 上样前，用加长的移液管头以上槽溶液冲洗管子。上样，倒转电极，400V 电泳 4 h。
(10) 电泳后，用一个 20 ml 的注射器慢慢地把凝胶挤入一个装有 4.75 ml 样品缓冲液的 15 ml 锥形瓶中。
(11) 在每管中加入 250 μl 的巯基乙醇，轻轻混合，室温平衡 5 min，在干冰/乙醇浴中迅速冷冻，保存于 -80℃。
(12) 制备第二向凝胶。按操作4 “单向凝胶电泳” 中步骤(1)~(3) 的方法用厚度为 1.5 mm 的垫片灌制凝胶，在浓缩胶中插一个单孔的梳子，插入约 0.5 cm。
(13) 在 37℃ 水浴中迅速解冻第一向凝胶，轻轻搅动。
(14) 把凝胶小心地放在梳子的位置，用平头镊子把凝胶弄直。确定玻璃板间凝胶的位置，轻轻地把第一向凝胶推到浓缩胶的上面。
(15) 进行第二向电泳，直至溴酚蓝跑出凝胶。然后固定、染色、显影 [ 见4 “单向凝胶电泳” 中步骤( 4)~(5) ]。
1. 细胞与代谢标记蛋白质
(1) HeLa S3 细胞的培养：含有 10% HeLa S3 细胞和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基。
(2) HeLa S3 细胞标记：无甲硫氨酸和胱氨酸的 DMEM，10% DMEM，5% 胎牛血清 ( FCS )，1% 青霉素/链霉素，20 μCi/ml TRANS ( ICN，COSTAMESA，CA，USA )。
2. 抗体和蛋白 A-Sepharose 凝胶
(1) 抗体：任何对特定的 hnRNP 蛋白有特异性并有高亲和力的单克隆抗体都可以用作免疫亲和纯化。成功应用的单克隆抗体有4B10 ( 抗 hnRNP A1)、4F4 ( 抗 hnRNP C1/C2 ) 和 4D11 ( 抗 hnRNP)。
(2) 蛋白 A-Sepharose ( pharmacyia Biotech，Piscataway，NJ.USA）。
3. 免疫纯化缓冲液
(1) 免疫纯化缓冲液 1 ( IPB1 )：RSB-100 [ 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，100 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L MgCl2 ]，0.5% Triton X-100，1 μg/ml 亮抑酶肽 ( leupetin )，1 μg/ml 胃酶抑制剂（peppstatin )，0.5% ( V/V ) 抑蛋白酶肽（aprotinin )。
(2) 免疫纯化缓冲液 2 ( IPB2 )：除了没有 Triton X-100 外，其余成分同 IPB1。
(3) 免疫纯化缓冲液 3 ( IPB3 )：PBS，1 mmol/L EDTA，1% 二甲基甜菜碱（Empigen BB )，0.1 mmol/L DTT。
(4) 免疫纯化缓冲液 4 ( IPB4 )：PBS，1 mmol/L EDTA，1% Triton X-100，0.5% 去氧胆酸，0.1% SDS，0.5% 抑蛋白酶肽。IPB4 可配制 5X 的储存液，在 4℃ 保存不超过一个月。
4. 单向凝胶电泳
(1) 试剂：10% ( m/V ) SDS ( 高压灭菌后室温保存 )；3% ( m/V ) 过硫酸铵（APS )，1 ml 每份， -20℃ 保存；TEMED。
(2) 分离胶用丙烯酰胺储存液：167.5 g（33.5%）丙烯酰胺和 1.5 g（0.3%）甲叉双丙烯酰胺溶于 45 ml 水中，搅拌直至完全溶解，加水至 500 ml，用 Whatman 1 号滤纸过滤。在棕色瓶中于 4℃ 可保存至少 2 个月。
(3) 分离胶缓冲液：1 mol/L Tris-HCl ( pH 9.1）。4℃ 至少可保存 3 个月。
(4) 浓缩胶用丙烯酰胺储存液：60 g（30%）丙烯酰胺和 0.88 g（0.44%）甲叉双丙烯酰胺溶于 175 ml 水中，搅拌直至完全溶解，补充水至 200 ml，用 Whaman 1 号滤纸过滤。在棕色瓶中于 4°C 可保存至少 2 个月。
(5) 浓缩胶缓冲液：0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8 )。4℃ 保存至少 3 个月。
(6) 2X 上样缓冲液：5 ml 0.5 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8)，8 ml 10% SDS，4 ml 重蒸馏甘油，2 ml β-巯基乙醇，2 mg 溴酚蓝，加水补充到 20 ml。-20°C 保存至少 4 个月。
(7) 4X 电泳缓冲液：96 g Tris 碱，460.8 g 甘氨酸，32 g SDS 溶于适量水中，最终补充到 8 L。室温避光保存。
(8) 设备：垂直凝胶电泳装置。
5. 双向非平衡 pH 凝胶电泳
(1) 试剂：超纯尿素；10% NP-40；40% Bin-Lyte 3/10 两性电解质（Bio-Rad公司）； 10% APS；TEMEI）。
(2) 等电聚焦（isofocusing ) 丙烯酰胺储存液：28.38 g 丙烯酰胺和 1.62 g 甲叉双丙烯酰胺溶于 90 ml 水中，搅拌至完全溶解，补充水至 100 ml。用 Whatman 1 号滤纸过滤，在棕色瓶中可保存 3 个月。
(3) 上槽缓冲液 ( 0.01 mol/L 磷酸）：1 ml 85% 的磷酸溶于 470 ml 水中。
(4) 下槽缓冲液（0.02 mol/L NaOH）：12 ml 1 mol/L NaOH 加入 600 ml 水中并用真空泵脱气 5 min。
(5) 样品缓冲液：1.43 g 超纯尿素，0.5 ml 10% Nonidet P-40，0.125 ml 40% ampholines，加水至 2.93 ml。分成 100 μl 每份，-70℃ 可保存 1 年。
(6) 95% 样品挤出缓冲液：混合 12.7 ml 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8 )，8 ml 甘油，10 ml 0.1% 溴酚蓝，20 ml 10% SDS，用水补充至 95 ml，室温保存。用前立即加 β-巯基乙醇至终浓度为 5%。
(7) 其他装置：管状凝胶电泳装置，垂直凝胶电泳装置，试管架，结核菌素注射器。
二、操作方法
1. 核质的制备
(1) HeLa 细胞培养至大部分发生融合，采用 [ 35S ] 甲硫氨酸进行蛋白质标记，倾去培养液后用无菌 PBS 冼涤一次，每 10 cm 培养皿加 5 ml 细胞标记培养基，培养过夜（8~12 h）。下面所有操作都采用 1.5 ml 离心管在 4°C 进行，每次亲和纯化约需半皿细胞。
(2) 每 10 cm 培养皿用 5 ml PBS 洗两次，加入 1.5 ml IPB1 后，用细胞刮刀彻底刮下细胞。用与注射器相连的 25 号针头吹打细胞悬液 4 次，操作时避免起泡沫。
(3) 3000 g 离心裂解液 3 min。
(4) 用 0.5 ml IPB2 重悬 XL 胞核沉淀，冰浴中超声 3 次，两次之间间隔 15 秒。
(5) 取 0.5 ml 30% 蔗糖 ( 用 IPB2 配制）加至离心管中，将超声后的溶液轻轻铺在蔗糖溶液表面，于 4800 g 离心 15 min。
(6) 移出在蔗糖液之上的核质部分（约 0.5 ml），加入 Triton X-100 至终浓度为 0.5%。
2. hnRNP 复合物的免疫纯化和凝胶分析
本方法是用抗 hnRNP 的单克隆抗体纯化 hnRNP 复合物。免疫纯化在非离子型去污剂条件下进行以避免破坏蛋白-蛋白和蛋白-RNA 相互作用。操作应迅速以最大程度降低核酸酶的作用，单克隆抗体预先结合在蛋白 A Sepharose 颗粒上，与核质的孵育不超 过 15 min。
(1) 所有步骤均在 4℃ 操作。加 1 ml IPB1 至离心管中，再加 1~5 μl 腹水，3 μl 兔抗鼠 IgG，50 μl 蛋白 A-Scpharose（50%，用PBS 配制混合后，置于混合器上于 4℃ 反应 1 h。
(2) 用 1 ml lPB1 涡旋振荡洗涤 3 次，离心 3 s，弃上清。
(3) 在每管含约 25 μl 结合抗体的蛋白 A-Sepharose 颗粒中加 250 μl 标记的核质，在 4℃ 混合 15 min。
(4) Sepharose 凝胶颗粒用 IPB1 洗 5 次，每次 1 ml，然后用 1 ml RSB-100 洗一次。
(5) 用配有 27 号针头的注射器除去过剩的液体，但不能使蛋白 A-Sepharose 干燥时间过长。
(6) 采用单向凝胶电泳进行分析，加 40 μl 2X 电泳上样缓冲液，100℃ 加热 3 min，微量离心机上最大转速离心 2 min，每个泳道上样 20 μl。
(7) 采用双向凝胶电泳分析，加 20 μl 同样的缓冲液和 2μl 20 mmol/L DTT。混合并在室温孵育 5 min。离心 30 s，上清再离心30 s。每个泳道上样 18~20 μl。按操作5 “双向凝胶电泳” 步骤 (1)~(5) 的方法电泳。
2. 特定 hnRNP 蛋白的免疫纯化和凝胶分析
通过免疫亲和纯化仅被单克隆抗体特异性识別的蛋白质 ( 特别是此蛋白不是已知的 hnRNP 复合体的成分时 ) 非常有用，可以采用以下两种方法，从标记的细胞提取物中直接免疫纯化或从纯化的 hnRNP 复合物中纯化。下面分别加以介绍：
(1) 从标记的细胞提取物中纯化。前面的步骤同操作1 “核质的制备” 中的步骤(1) 和(2)，但用 IPB3 或 IPB1 代替 IPB1 重悬细胞核沉淀，然后直接超声细胞裂解物 [ 操作1 “核质的制备” 中的步骤 (4) ] 。在离心管中以最大转速离心 10 min 去除沉淀，然后按操作2 “hnRNP 复合物的免疫纯化和凝胶分析” 的方法进行免疫纯化（用 IPB3 或 IPB4 代替 IPB1 )。
(2) 从免疫纯化的 hnRNP 中进行免疫纯化。按操作1 “hnRNP 复合物的免疫纯化和凝胶分析” 步骤(1)~(5) 的方法纯化 hnRNP 复合物。加 50~100 μl 含 1% SDS 的 RSB-100 并于 100℃ 加热 3 min 以解离复合物，然后冷却到室温，加 IPB4 稀释 10 倍（使 SDS 浓度降到约 0.1%）。最后按操作2 “hnRNP 复合物的免疫纯化和凝胶分析” 的方法纯化蛋白（用 IPB4 代替 IPB1 )。
4. 单向凝胶电泳
本实验中采用的不连续缓冲凝胶系统对低分子质暈和高分子质量的 hnRNP 均有较好的分辨率，且在真空凝胶干燥器中干燥时不易破裂。
(1) 12.5% 分离胶的配制。将 14.8 ml 分离胶用丙烯酰胺储存液、15.2 ml 电泳缓冲液、8.3 ml 水、0.4 ml 10% SDS、1 ml 3% 过硫酸铵（APS) 和 20 μ TEMED 混合。在电泳装置中灌制凝胶，上层以 0.1% SDS 覆盖，待其聚合。
(2) 浓缩胶的配制。将 1.3 ml 浓缩胶用丙烯酰胺储存液、2.5 ml 0.5 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8)、6.1 ml 水、0.1 ml 10% SDS、0.1 ml 过硫酸铵（APS ) 和 25 μl TEMED 混合。在聚合的分离胶上灌制约 1 cm 高的浓缩胶，插上梳子。
(3) 使用 Hoefcr SE400 凝胶电泳装置，20 μl 蛋白样品先采用 80 伏电压电泳使其浓缩，然后以 150V 电压电泳约 5 h，直至溴酚蓝完全泳出凝胶。
(4) 固定，染色。凝胶在 10% 乙酸、25% 异丙醇和 0.025% ( m/V ) 考马斯亮蓝中固定、染色过夜，然后用 10% 乙酸脱色 2 h。
(5) 显影。凝胶在 DMSO 中浸泡 15 min，倒掉 DMSO 并加入新的 DMSO 再浸泡 15 min。倒掉 DMSO，再加入含 22% 2，5-二苯恶唑（PPO ) 的 DMSO 浸泡 1 h，再倒掉，然后以流水洗 1 h。用加热真空凝胶干燥器干燥 1.5 h。
5. 双向凝胶电泳
因为 hnRNP 复合物由大量的蛋白质构成，所以采用双向电泳进行分析更能反映这些复合物的复杂性。由于人 hnRNP 复合物中含有大量的碱性蛋白，因此采用不平衡 pH 凝胶电泳进行第一向电泳。
(1) 第一向凝胶的制备。在一个放有搅拌子的 10 ml 烧杯中加入 1.38 g 超纯尿素、0.5 ml 10% NP40、125 μl 40% 两性电解质、0.49 ml 水，0.33 ml 等电聚焦丙烯酰胺储存液，这足够灌制 9 管凝胶。以封口膜盖住烧杯，搅拌混合 30 min 直至尿素完全溶解。不要加热丙烯酰胺溶液。
(2) 在混合丙烯酰胺溶液时，将制作模型用黏土平铺在干净的工作台上并用封口膜覆盖。将两根橡皮筋绕在试管架的外围并将试管架压入黏土中，同时在结核菌素注射器的前端加上一个 200 μl 的毛细管（离底部 11.5 cm 处作一记号）。
(3) 准备好凝胶溶液后，加入 4 μl 10% APS 和 5 μl TEMED，混匀，用注射器吸入丙烯酰胺溶液至液面刚过 11.5 cm 记号处。然后将毛细管通过固定在试管架外围的橡皮筋并固定在底端的黏土上，调整液面至刚刚为 5 cm 记号处，并检査是否有气泡。
(4) 所有凝胶灌注好后，在每个凝胶顶部覆盖 15 μl 8 mol/L 的尿素，并用封口膜盖住。聚合 4 h。
(5) 凝胶。聚合好后，去掉覆盖的尿素。选用等长的凝胶。
(6) 在管状凝胶装置的下槽加入脱过气的 NaOH 溶液。
(7) 用一个带 21 号弯曲针头的注射器吸掉胶管底部的气泡。
(8) 把胶管插入带橡胶接头的管架中，把管架放在下槽，上槽充满 0.01 mol/L 磷酸溶液。
(9) 上样前，用加长的移液管头以上槽溶液冲洗管子。上样，倒转电极，400V 电泳 4 h。
(10) 电泳后，用一个 20 ml 的注射器慢慢地把凝胶挤入一个装有 4.75 ml 样品缓冲液的 15 ml 锥形瓶中。
(11) 在每管中加入 250 μl 的巯基乙醇，轻轻混合，室温平衡 5 min，在干冰/乙醇浴中迅速冷冻，保存于 -80℃。
(12) 制备第二向凝胶。按操作4 “单向凝胶电泳” 中步骤(1)~(3) 的方法用厚度为 1.5 mm 的垫片灌制凝胶，在浓缩胶中插一个单孔的梳子，插入约 0.5 cm。
(13) 在 37℃ 水浴中迅速解冻第一向凝胶，轻轻搅动。
(14) 把凝胶小心地放在梳子的位置，用平头镊子把凝胶弄直。确定玻璃板间凝胶的位置，轻轻地把第一向凝胶推到浓缩胶的上面。
(15) 进行第二向电泳，直至溴酚蓝跑出凝胶。然后固定、染色、显影 [ 见4 “单向凝胶电泳” 中步骤( 4)~(5) ]。
来源：丁香实验
