材料与仪器
TE 牛肠碱性磷酸酶缓冲液 T4 多核苷酸激酶缓冲液 TBE 加样缓冲液 TBE 质粒 DNA 合适的限制酶 粉 氯仿 氯仿 异戊醇（3-甲基-1-丁醇） 乙醇 牛肠碱性磷酸酶 [γ-32P]ATP T4 多核苷酸激酶 乙酸铵 乙酸钠 丙烯酰胺 双丙烯酰胺 过硫酸铵 TEMED
SpeedVac 旋转浓缩器
SpeedVac 旋转浓缩器
步骤
材料与设备
质粒 DNA(含待分离序列特异性 DNA 结合因子的识别位点)
合适的限制酶
粉/氯仿（1:1;v/v)
氯仿/异戊醇（3-甲基-1-丁醇）（24:1;v/v)
乙醇（100% 和 75%;v/v)
牛肠碱性磷酸酶（BoehringtrMannheimCorp.713023)
[γ-32P]ATP(150uCi/ul;7000Ci/mmol;21pmol/ul)
T4 多核苷酸激酶（10U/ul)(Stratagene)
乙酸铵 (2.5mol/L)
乙酸钠 (3mol/L)
SpeedVac 旋转浓缩器（Savant Instruments，Inc.)
丙烯酰胺
双丙烯酰胺
过硫酸铵
TEMED(N,N,N'，N'-四甲基乙二胺）
试剂
TE
牛肠碱性磷酸酶缓冲液（10x)
T4 多核苷酸激酶缓冲液（10x)
TBE 加样缓冲液（5X)
TBE(10x)
(配方，见“试剂的配制” pp.131~138.)
操作程序
质粒 DNA
用于制备 DNA 酶 I 足迹探针的质粒 DNA 必须是高质量的（CsCl 纯化的)，其 RNA 杂质的含量必须很低。RNA 杂质会抑制激酶的反应。我们一般采用连续两步 CsCl 梯度法纯化 DNA。
第一次限制酶切消化
第一次限制酶切消化的目的是形成 5'突出端。酶切位点的位置应在离因子结合位点 50~200bp 范围内。
1) 质粒 DNA(50ug 的量较方便) 与第一个限制酶一起孵育，用琼脂糖凝胶电泳监测反应是否完全。
2)DNA 用 1:1 酚/氯仿和 24:1 氯仿/异戊醇各抽提一次。
3) 乙醇沉淀 DNA,TE 溶解，至终浓度为 1ug/ul。
去除 5'端的嫌酸
1) 每微克 DNA 中加入 1U 牛肠碱性磷酸酶 [例如，为使 50ugDNA 脱磷酸, 需在 500ul 总体积中加入 50U 磷酸酶（50U=50ul)〕。37°C 孵育 2 h。
2)DNA 用酚、1:1 酚/氯仿和 24:1 氯仿/异戊醇各抽提一次。
3) 乙醇沉淀 DNA,TE 溶解，至终浓度为 1ug/ul
注；一个便利的办法是将大量 (≥50ug)DNA 酶切消化和脱磷酸后作为储液储存起来，需要时标记少量 (一般为 5ug)DNA 备用。
标记 5'端
1) 于含 2ul 10xT4 多核苷酸激酶缓冲液的 11ul 水溶液中加入 5ul 经酶切消化和脱磷酸的 DNA(1ug/ul; 总量 5ug;5pmol5'端)，震荡混合。
2) 对此混合物，加入 1ul[γ-32P]ATP(标记 ATP 与 DNA5'端的摩尔比应为 2~4)，然后加入 1ul T4 多核苷酸激酶（此激酶是过量的)，反应终体积为 20ul。
3)37°C 孵育 1~2 h。
4) 加 200ul 2.5 ml/L 乙酸铵，震荡混合。微型离心机离心 0.5s, 使溶液回到离心管底部。
5)70°C 加热 15 min, 使激酶失活。置冰上冷却。
6) 加 660ul 100% 乙醇，颠倒混合 a 微型离心机离心 15 min, 沉淀 DNA。用吸头吸去上清。
注：应极小心，不要吸走 DNA 沉淀。并确认沉淀有适量水平的放射性。
7) 加 100ul TE, 震荡混合，溶解 DNA。
8) 加 100ul 1:1 酚/氯仿，震荡混合 1 min, 离心 5 min, 使分相。
9) 将上层转移至一新管，加入 10ul 3 ml/L 乙酸钠，震荡混合。
10) 加 300ul 100% 乙醇，颠倒混合。离心 15 min, 沉淀 DNA。用吸头吸去上清。
注：应极小心，不要吸走 DNA 沉淀。并确认沉淀有适量水平的放射性。
11) 加 800ul 75% 乙醇，颠倒混合。离心 15 min, 沉淀 DNA。用吸头吸去上清。
注：应极小心，不要吸走 DNA 沉淀，并确认沉淀有适量水平的放射性。
12) 用 SpeedVac 旋转浓缩器干燥沉淀。
13)DNA 溶于 10ulTE。
第二次限制酶切消化
第二次限制酶切消化的目的是产生 200~800bp 的标记 DNA 片段。
1) 探针 DNA 与第二种限制酶孵育。为保证此反应进行完全，建议尽可能地使用大大过量的酶，如対 5~10ug 的 DNA 甲 50~100U 的限制酶。
注：应注意限制酶的磷酸酶活性。通常用廉价的酶如 EcoRⅠ和 HindⅢ较合适。反应 80ul体积中进行较为方便。如需要，可用琼脂糖凝胶电泳监测反应的进程。
2) 用 1:1 酚/氯仿抽提 DNA。然后于 80ulDNA 中加入 20ul5xTBE 加样缓冲液，直接加样至 5% 聚丙烯酰胺（非变性) 凝胶。
标记限制酶切片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳
1) 按下列配方制备聚丙级酰胺凝胶 (20 cmX40 cmX1.5 mm; 有 4 个 3-cm 加样孔）：
丙稀酰胺 (30%;w/v)/双丙插醜胺 (0.8%;w/v)20.3 ml
TBE(10x)12.5 ml
H2092.2 ml
混合后过滤，然后加 750ul 10%(w/v) 过硫酸铵和 60ul TEMED。
2) 凝胶至少聚合 45 min，然后在 19W(约 400V) 下预电泳至少 lh。电泳时胶不应变热。
3) 加样，电泳一段所需时间后. 电压会缓慢地从 400V 增至 450~500V。
注：二甲苯腈蓝在 5% 胶上与 300-bp 限制酶切片段一起迁移。
从聚丙烯酰胺凝胶洗脱 DNA
本法用于≤8% 的聚丙烯酰胺凝胶，效果良好
1) 从胶板上切下有放射性的条带，应尽量减小条带的大小。
2) 用 18-G 号针（粉红色）在 l.5-ml 塑料微量离心管底打一小孔。
3) 将有孔的微量离心管底部插入另一 1.5-ml 微量离心管（无孔）中。
4) 将切下的胶块放入上一个有孔的微量离心管中。
5) 将两个微量离心管一起放在微型离心机中离心 15s。胶块通过小孔进入下一个微量离心管时应被破碎。
6) 加 300ul TE, 震荡混合。
7)37°C 孵育过夜。
8) 用 20-G 号针（黄色）在 1.5-ml 塑料微量离心管底打一小孔。在管底小孔之上填装约 200ul(装填结实后的体积) 硅化玻璃棉。硅化玻璃棉应装填结实于管底。然后，将此管的底部插入另一 1.5-ml微量离心管（无孔）中。用一尖端被刀片切去大约 2~3 mm 的 1000-ul 吸头（蓝色)，将 TE 和破碎胶块的混合物置于玻璃棉上，将这两个微量离心管制成的装置放在微型离心机中离心 10s。下管中应含有 TE 洗脱的 DNA 片段。
9) 乙醇沉淀探针 DNA, 然后溶于 TE。
10)-20°C 保存。
质粒 DNA(含待分离序列特异性 DNA 结合因子的识别位点)
合适的限制酶
粉/氯仿（1:1;v/v)
氯仿/异戊醇（3-甲基-1-丁醇）（24:1;v/v)
乙醇（100% 和 75%;v/v)
牛肠碱性磷酸酶（BoehringtrMannheimCorp.713023)
[γ-32P]ATP(150uCi/ul;7000Ci/mmol;21pmol/ul)
T4 多核苷酸激酶（10U/ul)(Stratagene)
乙酸铵 (2.5mol/L)
乙酸钠 (3mol/L)
SpeedVac 旋转浓缩器（Savant Instruments，Inc.)
丙烯酰胺
双丙烯酰胺
过硫酸铵
TEMED(N,N,N'，N'-四甲基乙二胺）
试剂
TE
牛肠碱性磷酸酶缓冲液（10x)
T4 多核苷酸激酶缓冲液（10x)
TBE 加样缓冲液（5X)
TBE(10x)
(配方，见“试剂的配制” pp.131~138.)
操作程序
质粒 DNA
用于制备 DNA 酶 I 足迹探针的质粒 DNA 必须是高质量的（CsCl 纯化的)，其 RNA 杂质的含量必须很低。RNA 杂质会抑制激酶的反应。我们一般采用连续两步 CsCl 梯度法纯化 DNA。
第一次限制酶切消化
第一次限制酶切消化的目的是形成 5'突出端。酶切位点的位置应在离因子结合位点 50~200bp 范围内。
1) 质粒 DNA(50ug 的量较方便) 与第一个限制酶一起孵育，用琼脂糖凝胶电泳监测反应是否完全。
2)DNA 用 1:1 酚/氯仿和 24:1 氯仿/异戊醇各抽提一次。
3) 乙醇沉淀 DNA,TE 溶解，至终浓度为 1ug/ul。
去除 5'端的嫌酸
1) 每微克 DNA 中加入 1U 牛肠碱性磷酸酶 [例如，为使 50ugDNA 脱磷酸, 需在 500ul 总体积中加入 50U 磷酸酶（50U=50ul)〕。37°C 孵育 2 h。
2)DNA 用酚、1:1 酚/氯仿和 24:1 氯仿/异戊醇各抽提一次。
3) 乙醇沉淀 DNA,TE 溶解，至终浓度为 1ug/ul
注；一个便利的办法是将大量 (≥50ug)DNA 酶切消化和脱磷酸后作为储液储存起来，需要时标记少量 (一般为 5ug)DNA 备用。
标记 5'端
1) 于含 2ul 10xT4 多核苷酸激酶缓冲液的 11ul 水溶液中加入 5ul 经酶切消化和脱磷酸的 DNA(1ug/ul; 总量 5ug;5pmol5'端)，震荡混合。
2) 对此混合物，加入 1ul[γ-32P]ATP(标记 ATP 与 DNA5'端的摩尔比应为 2~4)，然后加入 1ul T4 多核苷酸激酶（此激酶是过量的)，反应终体积为 20ul。
3)37°C 孵育 1~2 h。
4) 加 200ul 2.5 ml/L 乙酸铵，震荡混合。微型离心机离心 0.5s, 使溶液回到离心管底部。
5)70°C 加热 15 min, 使激酶失活。置冰上冷却。
6) 加 660ul 100% 乙醇，颠倒混合 a 微型离心机离心 15 min, 沉淀 DNA。用吸头吸去上清。
注：应极小心，不要吸走 DNA 沉淀。并确认沉淀有适量水平的放射性。
7) 加 100ul TE, 震荡混合，溶解 DNA。
8) 加 100ul 1:1 酚/氯仿，震荡混合 1 min, 离心 5 min, 使分相。
9) 将上层转移至一新管，加入 10ul 3 ml/L 乙酸钠，震荡混合。
10) 加 300ul 100% 乙醇，颠倒混合。离心 15 min, 沉淀 DNA。用吸头吸去上清。
注：应极小心，不要吸走 DNA 沉淀。并确认沉淀有适量水平的放射性。
11) 加 800ul 75% 乙醇，颠倒混合。离心 15 min, 沉淀 DNA。用吸头吸去上清。
注：应极小心，不要吸走 DNA 沉淀，并确认沉淀有适量水平的放射性。
12) 用 SpeedVac 旋转浓缩器干燥沉淀。
13)DNA 溶于 10ulTE。
第二次限制酶切消化
第二次限制酶切消化的目的是产生 200~800bp 的标记 DNA 片段。
1) 探针 DNA 与第二种限制酶孵育。为保证此反应进行完全，建议尽可能地使用大大过量的酶，如対 5~10ug 的 DNA 甲 50~100U 的限制酶。
注：应注意限制酶的磷酸酶活性。通常用廉价的酶如 EcoRⅠ和 HindⅢ较合适。反应 80ul体积中进行较为方便。如需要，可用琼脂糖凝胶电泳监测反应的进程。
2) 用 1:1 酚/氯仿抽提 DNA。然后于 80ulDNA 中加入 20ul5xTBE 加样缓冲液，直接加样至 5% 聚丙烯酰胺（非变性) 凝胶。
标记限制酶切片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳
1) 按下列配方制备聚丙级酰胺凝胶 (20 cmX40 cmX1.5 mm; 有 4 个 3-cm 加样孔）：
丙稀酰胺 (30%;w/v)/双丙插醜胺 (0.8%;w/v)20.3 ml
TBE(10x)12.5 ml
H2092.2 ml
混合后过滤，然后加 750ul 10%(w/v) 过硫酸铵和 60ul TEMED。
2) 凝胶至少聚合 45 min，然后在 19W(约 400V) 下预电泳至少 lh。电泳时胶不应变热。
3) 加样，电泳一段所需时间后. 电压会缓慢地从 400V 增至 450~500V。
注：二甲苯腈蓝在 5% 胶上与 300-bp 限制酶切片段一起迁移。
从聚丙烯酰胺凝胶洗脱 DNA
本法用于≤8% 的聚丙烯酰胺凝胶，效果良好
1) 从胶板上切下有放射性的条带，应尽量减小条带的大小。
2) 用 18-G 号针（粉红色）在 l.5-ml 塑料微量离心管底打一小孔。
3) 将有孔的微量离心管底部插入另一 1.5-ml 微量离心管（无孔）中。
4) 将切下的胶块放入上一个有孔的微量离心管中。
5) 将两个微量离心管一起放在微型离心机中离心 15s。胶块通过小孔进入下一个微量离心管时应被破碎。
6) 加 300ul TE, 震荡混合。
7)37°C 孵育过夜。
8) 用 20-G 号针（黄色）在 1.5-ml 塑料微量离心管底打一小孔。在管底小孔之上填装约 200ul(装填结实后的体积) 硅化玻璃棉。硅化玻璃棉应装填结实于管底。然后，将此管的底部插入另一 1.5-ml微量离心管（无孔）中。用一尖端被刀片切去大约 2~3 mm 的 1000-ul 吸头（蓝色)，将 TE 和破碎胶块的混合物置于玻璃棉上，将这两个微量离心管制成的装置放在微型离心机中离心 10s。下管中应含有 TE 洗脱的 DNA 片段。
9) 乙醇沉淀探针 DNA, 然后溶于 TE。
10)-20°C 保存。
来源：丁香实验
