PAP 法

SPA 除与标记物结合后用于代替第二抗体外，其本身可作为桥抗体用于 PAP 染色。与标记 SPA 相似，SPA 可与多种动物的第一抗体反应外，还可与多种 PAP 复合物反应，而不像 PAP 法需要与第一抗体相同的动物制备的各种 PAP 复合物。由于 SPA 与 Fc 段和 Fab 段结合为亲和化学反应，不是抗原-抗体的免疫反应，因而反应极为迅速，能大大减少实验时间。此法的敏感性不如 PAP 法，但背景染色要低于 PAP 法，而且较为方便。

1. 4 μm 石蜡切片常规脱蜡至水，PBS 洗 3×3 min。

2. IHC 的前处理视特异性一抗不同，可采用蛋白酶消化或热诱导的微波抗原修复（AR）。

3. PBS 洗 3×3 min。

4. 3％ 过氧化氢（H₂O₂）孵育 10 min（可省略），以阻断内源性过氧化物酶活性。

5. PBS 洗 3×3 min。

6. 20％ 蛋清 [用 0.01 mol/L（pH 7.3）PBS 配制] 孵育 20 min。

7. PBS 洗 3×3 min。

8. 10％ 非免疫性动物血清孵育 10 min（可省略），以减少非特异性背录，无需冲洗，只需吸去多余血清。

9. 滴加适当稀释的第一抗体，37℃ 温育 60 min，或 4℃ 过夜。

10. PBS 洗 3×3 min。

11. 加 SPA（1 μg/ml），37℃ 温育 30 min。

12. PBS 洗 3×3 min。

13. PAP 复合物（兔或鼠）37℃ 温育 30 min。

14. PBS 洗 3×3 min。

15. 0.04％ DAB（含 0.03％ H₂O₂）显色 5～10 min。

16. 复染，脱水，常规树胶封固，结果观察。