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免疫PCR要点与注意事项

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一、免疫PCR要点

(1)连接分子

免疫PCR需要适当的连接分子连接报告分子和抗原抗体复合物。1 992年Sano用重组的链亲和素-蛋白A嵌合体作为连接分子,创立了免疫PCR技术。该融合蛋白的蛋白A可结合抗体的Fc段,链亲和素可结合DNA分子上的生物素,Sano利用此连接分子把一段生物素化的DNA(PUC19质粒DNA)连接到固定在酶标板上的抗原抗体复合物上,成功的检测到了牛血清蛋白,比传统ELISA法的敏感生105倍。

1993年,Ruzicha用生物素化单抗-亲和素-生物素化DNA分子复合体代替链亲和素-蛋白A嵌合体连接的单抗DNA复合体。Zhou等人发现链亲和素(streptavidin)不含糖基,做连接分子特异性优于亲和素(avidin);Marian进一步指出中性链亲和素(neutravidin)特异性比链亲和素更佳,因为前者是一种经过特殊修饰了的亲和素,大大降低了非特异性吸附的可能。此后链亲和素(亲和素)系统被广泛应用,二者作为免疫PCR的连接分子各有优缺点。链亲和素-蛋白A嵌合体均一稳定,结果重复性好,并且此嵌合蛋白可以利用工程菌大量生产,价格低廉。但目前尚无商品化的产品可以利用,且蛋白A可以结合非特异性吸附的抗体或用于捕获抗原的抗体的Fc段,使之不能用于夹心法。预先把特异性抗体和该连接分子制成复合物可解决上述问题,用抗体的Fab或F(ab′)2段代替捕获抗原的一抗也可克服以上困难。

生物素、链亲和素系统有商品化的生物素标记的二抗和游离链亲和素可以利用,因而被国内外学者广泛采用。但亲和素为四价化合物,在制备亲和素-生物素化DNA复合体(avidin-biotinylated-DNA complex ABD complex)时会出现3种情况5种分子,即游离亲和素、部分饱和亲和素(结合1-3个生物素分子)、饱和亲和素。只有部分饱和亲和素对检测有用,其他两种情况不但对检测无用而且占用检测位点,降低免疫PCR的敏感性。有的学者采用分别加入生物素化二抗、游离亲和素生物素化DNA分子的方法克服了以上缺点,但延长了检测周期,使检测步骤繁锁,增加了系统误差。有人用2-亚氨基生物素做配基的琼脂糖珠亲和层析法制备ABD复合物,克服了以上不足。

(2)报告分子

理论上任何一段序列已知、可有效扩增的DNA都可作为免疫PCR的报告分子,但考虑到DNA序列的同源性和用于PCR扩增的效率问题,该报告分子和PCR扩增系统必须保证有良好的扩增效果,有近似理论的扩增率,该报告分子与反应体系中可能存在DNA分子不应有同源性,以避免因DNA污染,而出现特异性扩增。继Sano用PUC19质粒后,国内外学者先后用PINM30、λ噬菌体、舌兰病毒等作为报告分子,取得了良好的效果。郑永晨研究发现线性化的腺病毒六邻体(AdAt)基因重组质粒非常适于做免疫PCR的报告分子。目前免疫PCR的报告分子多数是用DNA聚合酶将生物素化的碱基聚合到DNA末端,理论上一条DNA链上只标记一个生物素分子才具有最高的敏感性。AdAt质粒易于制备和纯化,分子较单一,不易出现非特异扩增,经Hind Ⅲ 酶切后粘性末端上只有加一个生物素分子,保证了免疫PCR的最高敏感性。质粒pHNL10含有编码木薯羟基腈裂解酶的基因,该基因片段是从木薯cDNA文库中经PCR扩增所得,植物DNA与检测系统中可能存在的任何DNA都不同源,用它做免疫PCR的报告分子,可避免因DNA污染而造成的非特异性扩增。

(3)免疫PCR的载体

由于适合抗原抗体反应的酶标板不能插入普通PCR仪进行PCR反应,Sano先在酶标板上进行抗原抗体反应和报告分子的连接反应,然后经过热变性,把酶标板上的报告分子转移到普通PCR管中进行PCR反应。此法简单、经济,但步骤繁锁,容易在转移过程中丢失样品,系统误差大,结果不稳定。国外有人用特殊的96孔中V形板做载体,所有步骤均在同一板上进行,最后插入特殊的PCR仪进行扩增。此法克服了上述缺点,但需特殊的PCR仪,价格昂贵,目前尚不能在国内推广普及。用于PCR反应的eppendof管多用聚氯乙烯,在材料上有别于酶标反应板,不适合包被抗原(抗体)。徐平西等人用戊二醛做包被剂将抗原(抗体)高效率地包被于普通PCR管,使免疫PCR能利用普通PCR仪在同一管中连贯进行。

(4)免疫PCR的显示系统

最基本的显示方法是凝胶电泳法。PCR产物经葡聚糖凝胶电泳后,EB染色,紫外线灯下观察或照像,出现特异性扩增带为阳性。也有人将电泳后的PCR产物印记在硝酸纤维素膜上进行核酸杂交,以杂交信号显示检测结果。另外也可不用电泳,在PCR扩增时用放射性同位素、荧光素、生物素、酶等标记引物,使PCR产物带有一定标记,然后通过放射自显影、荧光显微镜、酶底物显色等显示检测结果。凝胶电泳法既适合单抗原的检测,又适合多抗原的检测,且能区分PCR产物的特异性扩增带和非特异性扩增带,除了EB染液对人体有害需防护外,对环境基本无污染,因而被广泛应用。其他方法一般只适合于单抗原检测,对引物要求较高,且无法区分非特异性扩增带,因此应用较少。
 

 

(5)假阳性的控制

充分洗涤是必要的,有的学者总共用了50多次洗涤,最大限度地消除了非特异性吸附,但同时也增加了检测步骤,延长了检测周期。充分封闭非特异性结合位点也至关重要,常用的封闭剂有牛血清蛋白(BSA)、脱脂奶粉、鲑鱼精DNA,Chang在PBS中加入2%的BSA取得了良好的效果。适当降低报告分子的浓度,采用不等量引物(适当减少其中一种引物的浓度)均可减少非特异性扩增,提高特异性。另外应设立假阳性指示分子和阴性对照。

免疫PCR优化策略及改进

(1)免疫PCR的优化策略--新型连接分子的出现

1)叶绿素分子和链酶卵白素

乔生军等用自然界普遍存在的叶绿素分子(chlorophy)作为共价连接蛋白与核酸的中间分子,构建了甲胎蛋白(AFP)抗体的基因探针,此探针人为地把抗体直接锚定在双链DNA分子上,复合分子性质均一稳定,室温至少保存6个月,大大简化了中间步骤,降低了成本,使免疫PCR更易推广。也有人用链酶卵白素将生物素化的抗体与生物素化的DNA分子直接连接,也得了良好的较果。

2)双特异融合蛋白

任军将编码单链抗体和链亲和素融合蛋白的基因插入载体在大肠杆菌中进行表达,获得了具备结合生物素和抗原分子的双特异性融合蛋白,可直接连接抗体和生物素化的DNA分子。该融合蛋白可利用工程菌大量制备,性质优良,价格低廉。 (责任编辑:大汉昆仑王)

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