免疫PCR(IM-PCR)注意事项
互联网
1256
免疫PCR(IM-PCR)注意事项
(1)固相载体的选择：主要取决于抗原在固相载体上的吸附程度。如果抗原吸附良好，可以进行IM-PCR。如果抗原吸附不良，则需选用双抗体夹心IM―PCR。另外选用的固相载体要和PCR仪器相匹配。一般用0.5ml的塑料反应管，也可以用微量滴定板。
(2)待检抗原的特异性抗体：这是决定本法特异性和敏感性的关键试剂，使用相应的McAb为宜。将抗体进行生物素标记后，可用于直接IM―PCR，或以生物素化的二抗来连接亲合素和生物素化DNA分子，用于间接IM―PCR。
(3)连接分子：用于连接两个不同的分子，在IM―PCR中，就是把作为模板的DNA标记分子连接到目的物(例如抗原)上去。并且要求此种连接是特异的，高亲和性的。为此，常用生物素及其结合蛋白―亲合素或链霉亲合素作为连接分子。只要将需要连接的分子标以生物素，就可以通过亲合素将它们连接起来。Sano等(1992)用的是重组的链霉亲合素与A蛋白的嵌合体，它一方面可借亲合素与生物素化DNA分子(质粒)相结合，另一方面可以通过A蛋白与所测抗原的相应抗体(IgG)的Fc段相结合。此种连接分子操作步骤少，但A蛋白部分可引起非特异性结合，使反应的本底增高，而且无市售商品试剂可得。后来Ruzicka等(1993)用亲合素―生物素化DNA复合物作为连接分子。系用亲合素与生物素化的特异性DNA分子相结合而制得，其优点是亲合素有市售品可获得。与亲合素相连结的特异性抗体一生物素结合物也有商品试剂存在的问题,主要是亲合素分子有4个亚基可分别与生物素分子相连接,于是在制备复合物时，可因反应物的浓度差异，生成5种不同饱和度的产物。这种不均一性使得反应的敏感性和重复性降低。因此，Zhou 等主张将亲合素独立地加入，并认为这是保证重复性的简化步骤。目前使用的亲合素有链霉亲合素和一般亲合素两种。
(4)DNA标记分子：作为标记分子，应当考虑其来源和效果。一般应是在样品中绝对不存在，而且纯度高，均质性好的DNA。为此，选用质粒DNA或PCR扩增产物为宜。为了保证生物素标记的DNA与亲合素结合的均质性，以用饱和浓度为佳。
(5)引物：除与DNA分子互补外，还须考虑到它的特异性、敏感性或扩增效果。因为所用引物的浓度过高时，会由于非特异性结合使本底过高；浓度过低时，又会使敏感度降低。一般如需定量检测，选用饱和量的引物。
