免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项
丁香实验
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一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：
1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS （1：1）。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项
1、荧光染色后一般在 1h 内完成观察，或于 4℃ 保存 4h ，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：
（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物；
（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物；
（3）荧光标记物对照：PBS +荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈
1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是 donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。
2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗 4℃ 孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的 IgG，荧光标记物对照是 PBS+ 荧光标记物。
4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是 10% 正常 donkey 血清。
5、其余事项同免疫荧光单标操作。
