免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项

一、免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化，不同点如下：

1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同。

2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS （1：1）。

5、条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久。

6、荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光。

7、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照。

二、注意事项

1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。

2、每次试验时，需设置以下三种对照：

（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物

（2） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物

（3） 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物

三、免疫荧光双标的经验之谈

1、选取primary antibodies时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，secondary antibodies则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。

2、我的做法是两种primary antibodies同时孵育，然后两种secondary antibodies同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真摸索，我感觉primary antibodies 4度孵育过夜比较好，背景比较干净。

3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是rabitt和rat的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

4、Block用的血清使secondary antibody来源动物的血清，我的是10%正常donkey血清。

5、其余同一般操作。