流感病毒细胞分离培养
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一、组织培养概况
(一)组织培养定义
组织或
细胞培养
是指从机体中取出组织或细胞,模拟机体内的生理条件在体外进行培养,使之生存和生长。
(二)、组织培养的原理
组织培养主要是为病毒易感的组织细胞提供一个良好的生存环境,使细胞对环境产生适应性,获得生长繁殖的能力。
病毒在敏感细胞中繁殖,常可引起细胞代谢等方面的变化,可出现细胞病变并释放病毒到维持液中,这种情况可用细胞病变、色变法及检测维持液中病毒抗原的方法,判定病毒的存在及滴度。
有些病毒不引起细胞病变,有些在核内繁殖不易释放到维持液中,前者可用干扰的方法及免疫荧光的方法来检测病毒,后者常采用冻融破坏细胞获得病毒后检测。
(三)、组织培养所需的材料和条件
1、组织或细胞来源:
人、猴、啮齿类、禽的胚胎、脏器以及昆虫等为组织培养常见的组织来源。用于病毒培养的往往是病毒的自然宿主细胞。如人类病毒用人和猴组织较敏感,但有些病毒用其他宿主细胞亦很敏感,如乙脑病毒对白纹伊蚊细胞系C6/36较人的细胞更为敏感。流感病毒对狗肾传代细胞(Madin darby canine kidney,MDCK)亦很敏感 。
2、单细胞的制备(略)
3. 细胞培养 的基本条件:
(1)细胞接种数:细胞量越大繁殖的速度越快,接种传代细胞一般为10—30万/ml。
(2)合成培养液:如Eagle氏液,RPMI1640,Eagle’s MEM。 不同培养液各有其特点,但往往也适用于各种
细胞培养
,其主要成分为氨基酸、碳水化合物、维生素、无机盐及其他成分。配制培养液的水一般用单蒸后的去离子水。
合成培养液中不含蛋白质成分,血清蛋白对组织培养是不可缺少的;不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁,不同血清对细胞促进作用不同,以胎牛血清最好,每批血清使用前需以56℃30分钟灭活处理。含有10%血清的培养液能促进细胞增殖,称为生长液。
(3)酸碱度:细胞生长最适宜的PH范围是7.0–7.4。培养环境偏酸较偏碱更宜于细胞贴壁。PH的变化主要取决于,HCO 3 - 浓度、二氧化碳分压,细胞糖代谢能力。使用二氧化碳培养箱,能提供稳定的5%二氧化碳。可自动调节细胞代谢引起的PH改变。
(4)温度: 细胞培养 的最适温度与细胞来源的动物体温一致,温度增加2–3℃对细胞产生不良影响,使之在24h内死亡。低温对细胞影响较小。
(5)无菌条件:细胞培养的关键之一是要有无菌概念,要防止污染。在 细胞培养 中,可能发生污染的来源很多,有组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身、空气等。因此要对培养液、器皿用具、操作室进行彻底消毒,在操作时要严格实行无菌操作。
(6) 培养器皿的处理:培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长影响很大。常用的器皿主要有玻璃及塑料二大类。玻璃器皿一般须用清洁液浸泡过夜、清水洗10次后再用蒸馏水洗2次,烤干备用。塑料板一般用2%NaOH浸泡1小时后,清水洗净再用1N HCl浸泡1小时,用清水洗后再用蒸馏水漂洗。37℃干燥后,紫外线照射消毒。
(四)组织培养的优缺点及应用范围:
优点:可提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象,对疫苗生产来说,其抗原性更接近于自然流行株,可减少宿主蛋白成分,减少变态反应。
缺点:病毒复制后滴度低,不易保存,保存时易使病毒滴度丢失,传代细胞含致癌因子,不宜用于疫苗生产。且随着细胞代数增加,对病毒敏感性也随之下降。
应用范围:目前组织培养技术已应用于病毒学的各个部门,不仅应用于病毒性疾病的诊断及疫苗制备,也深入应用到病毒学基础理论的研究