流感病毒细胞分离培养

 

一、组织培养概况
（一）组织培养定义
组织或 细胞培养 是指从机体中取出组织或细胞，模拟机体内的生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。

（二）、组织培养的原理
组织培养主要是为病毒易感的组织细胞提供一个良好的生存环境，使细胞对环境产生适应性，获得生长繁殖的能力。
病毒在敏感细胞中繁殖，常可引起细胞代谢等方面的变化，可出现细胞病变并释放病毒到维持液中，这种情况可用细胞病变、色变法及检测维持液中病毒抗原的方法，判定病毒的存在及滴度。
有些病毒不引起细胞病变，有些在核内繁殖不易释放到维持液中，前者可用干扰的方法及免疫荧光的方法来检测病毒，后者常采用冻融破坏细胞获得病毒后检测。
（三）、组织培养所需的材料和条件
1、组织或细胞来源：

人、猴、啮齿类、禽的胚胎、脏器以及昆虫等为组织培养常见的组织来源。用于病毒培养的往往是病毒的自然宿主细胞。如人类病毒用人和猴组织较敏感，但有些病毒用其他宿主细胞亦很敏感，如乙脑病毒对白纹伊蚊细胞系C6/36较人的细胞更为敏感。流感病毒对狗肾传代细胞（Madin darby canine kidney,MDCK）亦很敏感 。

2、单细胞的制备（略）

3． 细胞培养 的基本条件：

（1）细胞接种数：细胞量越大繁殖的速度越快，接种传代细胞一般为10—30万/ml。

（2）合成培养液：如Eagle氏液，RPMI1640，Eagle’s MEM。 不同培养液各有其特点，但往往也适用于各种 细胞培养 ，其主要成分为氨基酸、碳水化合物、维生素、无机盐及其他成分。配制培养液的水一般用单蒸后的去离子水。
合成培养液中不含蛋白质成分，血清蛋白对组织培养是不可缺少的；不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁，不同血清对细胞促进作用不同，以胎牛血清最好，每批血清使用前需以56℃30分钟灭活处理。含有10%血清的培养液能促进细胞增殖，称为生长液。

（3）酸碱度：细胞生长最适宜的PH范围是7.0–7.4。培养环境偏酸较偏碱更宜于细胞贴壁。PH的变化主要取决于，HCO ₃ ^- 浓度、二氧化碳分压，细胞糖代谢能力。使用二氧化碳培养箱，能提供稳定的5%二氧化碳。可自动调节细胞代谢引起的PH改变。

（4）温度： 细胞培养 的最适温度与细胞来源的动物体温一致，温度增加2–3℃对细胞产生不良影响，使之在24h内死亡。低温对细胞影响较小。

（5）无菌条件：细胞培养的关键之一是要有无菌概念，要防止污染。在 细胞培养 中，可能发生污染的来源很多，有组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身、空气等。因此要对培养液、器皿用具、操作室进行彻底消毒，在操作时要严格实行无菌操作。

（6） 培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长影响很大。常用的器皿主要有玻璃及塑料二大类。玻璃器皿一般须用清洁液浸泡过夜、清水洗10次后再用蒸馏水洗2次，烤干备用。塑料板一般用2%NaOH浸泡1小时后，清水洗净再用1N HCl浸泡1小时，用清水洗后再用蒸馏水漂洗。37℃干燥后，紫外线照射消毒。
(四）组织培养的优缺点及应用范围：

优点：可提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，对疫苗生产来说，其抗原性更接近于自然流行株，可减少宿主蛋白成分，减少变态反应。
缺点：病毒复制后滴度低，不易保存，保存时易使病毒滴度丢失，传代细胞含致癌因子，不宜用于疫苗生产。且随着细胞代数增加，对病毒敏感性也随之下降。
应用范围：目前组织培养技术已应用于病毒学的各个部门，不仅应用于病毒性疾病的诊断及疫苗制备，也深入应用到病毒学基础理论的研究