流感病毒的MDCK细胞分离方法

一、目的

流感病毒的MDCK细胞分离方法是流感实验的关键技术，用于流感病毒的分离、培养。本SOP是为确保MDCK细胞分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。

二、范围

适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离。

三、程序

（一）生物安全要求

H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别：BSL-3。实验操作人员需进行BSL-3防护，具体详见“生物安全个人防护SOP”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。

其余流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别：BSL-2。实验操作人员需进行BSL-2防护，具体详见“生物安全个人防护SOP”。其余流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。

（二）材料

1、75％～90％成片的MDCK细胞，选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离

2、胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）

3、HEPES缓冲液，1M母液

4、D-MEM培养基，Hank's液

5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素

6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液

7、临床样品0.5mL

8、1mL无菌移液管

9、10mL无菌移液管

10、15mL无菌离心管

（三）实验步骤

1、准备病毒生长液

（1）细胞维持液准备

500mL D-MEM液中加入

①青、链霉素母液 5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）

②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：0.2%）

③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度：25mM）

（2）病毒生长液

每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的终浓度为2µg/mL。

2．流感病毒MDCK细胞分离步骤：

（1）75％～90％成片细胞的准备，以选取T25细胞瓶为例。

①用40×物镜观察细胞生长状态。

②轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。

（2）细胞培养瓶的接种

①用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。

②用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。

③然后放于37℃，5%CO2培养箱中吸附1～2h。

④吸出接种物，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养瓶中。

⑤放置于33～35℃培养箱培养。

⑥每日观察细胞病变情况。（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。

（3）细胞培养物的收获

当75%～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。收获的病毒液可以立即进行后续试验，或冻于-80℃冰箱待以后试验使用。