应用反向遗传学获得流感病毒

应用反向遗传学获得流感病毒

材料

试剂

牛血清白蛋白

细胞

239T 细 胞 （ATCC， CRL-11268)

犬 肾 细 胞 （M D C K ， A T C C ， CCL-34)

在转染前，细胞应该在75cm2 细胞培养瓶中生长到汇合。

D M EM

胎 牛 血 清 （F C S )

Lipofectam ine 2000 试 剂 （ Invitrogen 11668-027)

O pti-M E M I 低 血 清 培 养 基 （ GIBCO 31985)

磷 酸 盐 缓 冲 液 （PBS)

质 粒 （0.5ug/ml) ，转 染 纯 度

蛋 白 质 表 达 载 体

为以下每一个蛋白质准备一个单独的载体： PA、 PB1、 PB2、 NP。

R N A 表 达 载 体

为以下每一个流感病毒片段准备一个单独的载体： v R N A H A 、 M 、 N A 、 N P 、 N S 、 P A 、PBl, PB2„

T P C K -胰 岛 素 （Sigm a-A ldrich T -8802)

仪器

细 胞 培 养 皿 （35m m 2)

细 胞 培 养 瓶 （75cm2)

培 养 箱 （37°C ， 5 % CO2)

6 孔 细 胞 培 养 板

方法

1 . 将 8 种 R N A 表达质粒和4 种蛋白质表达质粒各0.5吨 混 合 。室温下，使 用 0pti_M E M 培养基稀释到最终量为l 〇〇 Ml 。

2•在第二个管中加人6ul Lipofectamine和9知1 Opti-M EM 培养基。混合好，室温孵育 5min0

3 . 在 DNA混 合 液 （步 骤 1 ) 中加入IOOfJ 转 染 试 剂 主 混 合 液 （步 骤 2)。轻敲小管混勻。室温孵育20min。

4 . 胰蛋白酶处理汇合的239T 和 M D C K 细胞。分离的细胞在IOml室 温 D M E M [含1 0 % F C S (不含抗生素) ] 中重悬。

5.300g 左右离心5m in 。 IOml室温 D M E M [含 1 0 % F C S (不含抗生素) ] 中 重 悬 。

6.I : 1 混合293T 和 MDCK细胞。每 35mm2 平皿加人IOml混合细胞。

7 . 在平皿中加入DNA/Lipofectamine混合液。晃动平皿使其混勻，使细胞分布均勻。37°C培 养 6〜24h。

8 . 培养基换为 O pti-M E M (含 0. 0 1 % F C S , 0 •3 % BSA 和 l Mg /m l 的 T P C K -胰岛素）。继续培养。

9•病毒转染前一天（如大概2处的后转染期） ，将 MDCK接 种 在 6 孔细胞培养板 上 。37°C培养。

10.48h 后传染，收集浮在表面的转染混合细胞， 7000g 离心取上清。

11.移 除 6 孔培养板培养M D C K 细胞中的培养基。

M D C K 细胞在转染时应该达到8 0 % 〜9 0 % 的 汇 合 度 （48h 后传染)。

12.P B S 洗细胞两次。加入步骤1〇获得的上清200/xl。 37°C 振荡培养l h 。

1 3 . 加入 2m l O p t i - M E M (含 0• 0 1 % F C S , 0. 3 % B S A 和 1/zg/m l 的 T P C K 胰岛素） 。37°(；, 5 % ( ：0 2 培养箱培养。

1 4 . 每天检查由转染上清液感染的细胞，包括其 C P E 的出现和H A 在培养上清液中的含量变化。