土井挞克树
原核表达要注意控制表达条件,病毒表达相对简单。
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表达重组蛋白通常需要考虑多个因素,包括宿主菌种选择、表达载体的构建、表达条件的优化等等。对于流感HA的原核表达,以下几点可能会有帮助:
宿主菌种选择:不同的宿主菌对于重组蛋白的表达和折叠有不同的影响。常见的宿主菌有大肠杆菌(E. coli)、窄叶拟杆菌(P. pastoris)等。对于流感HA的原核表达,E. coli是一个常见的选择。
表达载体的构建:表达载体的设计和构建对于重组蛋白的表达也非常关键。建议选择经过优化的表达载体,并在其上添加适当的表达标签,如6xHis标签等,方便后续的纯化和检测。
表达条件的优化:表达条件的优化包括感染细胞密度、诱导剂浓度、表达时间等。建议通过单因素实验或正交实验等方法进行优化,找到适合流感HA表达的最佳条件。
纯化和鉴定:对于表达的流感HA,还需要进行纯化和鉴定。常见的纯化方法包括亲和层析、凝胶过滤层析等,鉴定方法包括SDS-PAGE、Western blotting等。
如果以上方法均已尝试,仍然无法表达出目标蛋白,可以考虑检查表达载体的序列是否正确,或者尝试更换宿主菌或表达条件等。
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主要从以下几点考虑与分析:
1、翻译起始位点
2、GC含量
3、mRNA二级结构
4、密码子的偏爱性
5、质粒载体的选择
6、外源基因对宿主有毒性
7、基因突变(移筐突变)
8、培养诱导条件
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