【求助】有人做过ikbβ和NF-KB的ELISA吗？
丁香园论坛
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小弟对于实验处于纯菜鸟，糊里糊涂的做了半年多了，结果数据参差不齐，临近毕业，焦虑万分，特停高手们指导求救！
我做的是大鼠的系膜细胞，用TNF-α刺激后，再用中药干预24h，测细胞上清中的ikb和NF-KB,用的都是ELISA法。
ikb测值很低，据查当IKBα被磷酸化后分解后，P65和P50才能解离激活。所以，当刺激开始的时候，磷酸化的IKBα上调，IKBα下调。由于P65活化后又可以上调IKBα表达，所以，经过一定时间之后，IKBα恢复。从开始下降－最低点－开始增多－恢复，这是一个变化过程。
问题一：我测定是ikbβ是否有同仁能介绍一下其水平变化趋势？是否同ikbα？
问题二：大家好像都做NF-KB的EMSA,有人做过NF-KB的ELISA吗？来，叫一声！
问题三：如证明NF-KB同MCP-1的通路，需要加做NF-KB的抑制剂PDTC的话，细胞怎么的做？
还有好多问题，不吃不睡等你们
谢谢！
我做的是大鼠的系膜细胞，用TNF-α刺激后，再用中药干预24h，测细胞上清中的ikb和NF-KB,用的都是ELISA法。
ikb测值很低，据查当IKBα被磷酸化后分解后，P65和P50才能解离激活。所以，当刺激开始的时候，磷酸化的IKBα上调，IKBα下调。由于P65活化后又可以上调IKBα表达，所以，经过一定时间之后，IKBα恢复。从开始下降－最低点－开始增多－恢复，这是一个变化过程。
问题一：我测定是ikbβ是否有同仁能介绍一下其水平变化趋势？是否同ikbα？
问题二：大家好像都做NF-KB的EMSA,有人做过NF-KB的ELISA吗？来，叫一声！
问题三：如证明NF-KB同MCP-1的通路，需要加做NF-KB的抑制剂PDTC的话，细胞怎么的做？
还有好多问题，不吃不睡等你们
谢谢！
回答一下问题2吧：
一般来讲：检测NF-KB时有不同的目的，有的是检测其细胞内表达量的变化，这时用western最好。有时候也用western分别检测NF-KB在胞浆和胞核内的含量，从而研究NF-KB的转位情况（从胞浆到胞核），并同时使用共聚焦显微镜的照片作为支持证据。另外，你说ELISA法主要是检测NF-KB与DNA的结合能力的，这种检测也可以用EMSA法。另外还有一种就是报告基因法，用来检测NF-KB与DNA结合后的转录活性的。
我觉得一般都是用western检测细胞内的ikb和NF-KB吧，ikb和NF-KB能被分泌到细胞外吗？
一般来讲：检测NF-KB时有不同的目的，有的是检测其细胞内表达量的变化，这时用western最好。有时候也用western分别检测NF-KB在胞浆和胞核内的含量，从而研究NF-KB的转位情况（从胞浆到胞核），并同时使用共聚焦显微镜的照片作为支持证据。另外，你说ELISA法主要是检测NF-KB与DNA的结合能力的，这种检测也可以用EMSA法。另外还有一种就是报告基因法，用来检测NF-KB与DNA结合后的转录活性的。
我觉得一般都是用western检测细胞内的ikb和NF-KB吧，ikb和NF-KB能被分泌到细胞外吗？
不要意思，更正一下
我测NF-KB用的是细胞核提取液，用专门的细胞核提取试剂盒；而ikb用的样品是细胞质提取液，是按其说明书自己买试剂盒提取的。
我测的ikb的值较低，我在ELISA用的每孔加50、100、200、300ul，及用1个100mm的培养皿的细胞提取的细胞质，均不能提高ikb的od值，是否存在加大浓度太大，可能再稀释会好点？有人做过吗？
最后先谢谢magichunter的回复！
我测NF-KB用的是细胞核提取液，用专门的细胞核提取试剂盒；而ikb用的样品是细胞质提取液，是按其说明书自己买试剂盒提取的。
我测的ikb的值较低，我在ELISA用的每孔加50、100、200、300ul，及用1个100mm的培养皿的细胞提取的细胞质，均不能提高ikb的od值，是否存在加大浓度太大，可能再稀释会好点？有人做过吗？
最后先谢谢magichunter的回复！
ws88523758 wrote:
小弟对于实验处于纯菜鸟，糊里糊涂的做了半年多了，结果数据参差不齐，临近毕业，焦虑万分，特停高手们指导求救！
我做的是大鼠的系膜细胞，用TNF-α刺激后，再用中药干预24h，测细胞上清中的ikb和NF-KB,用的都是ELISA法。
ikb测值很低，据查当IKBα被磷酸化后分解后，P65和P50才能解离激活。所以，当刺激开始的时候，磷酸化的IKBα上调，IKBα下调。由于P65活化后又可以上调IKBα表达，所以，经过一定时间之后，IKBα恢复。从开始下降－最低点－开始增多－恢复，这是一个变化过程。
问题一：我测定是ikbβ是否有同仁能介绍一下其水平变化趋势？是否同ikbα？
问题二：大家好像都做NF-KB的EMSA,有人做过NF-KB的ELISA吗？来，叫一声！
问题三：如证明NF-KB同MCP-1的通路，需要加做NF-KB的抑制剂PDTC的话，细胞怎么的做？
还有好多问题，不吃不睡等你们
谢谢！
问题1，各个实验具体不一样，所以结果不能想当然，可能在我的细胞是上升但是在你的实验却是下降的。而且个人觉得带有主观想法去做实验不是一个正确的做法。
问题2，ELISA法检测NF-KB其实原理和EMSA一样，提取细胞核蛋白然后加入包被有NF-KB结合核酸序列的ELISA板上，加入一抗二抗然后显色，也就是说检测的是能够和相关序列结合的NF-KB的量。CLONTECH和ACTIVE MOTIF都有，质量很好，而且顶级杂志都有引用，我们当时用的就是CLONTECH的，不错，就是比较贵。
问题3，肯定要做的，就是加入抑制剂（摸作用浓度和时间），然后检测下游相关基因的表达。
谢谢！谢谢！
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