反向遗传学技术及其在FMDV 研究中的应用

互联网2013-09-06

1538

刘光清　刘在新　谢庆阁 (中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州730046) 摘　要: 　反向遗传技术是一种新兴的分子生物学技术, 已广泛应用于生命科学研究的各个领域。综述反向 遗传技术研究进展,并讨论该技术在口蹄疫病毒研究中的应用。 关键词: 　反向遗传学　反向遗传技术　全长cDNA 　口蹄疫病毒 Reverse Genetic Technique and Its Application in FMDV Research Liu Guangqing 　Liu Zaixin 　Xie Qingge ( L anz hou Veteri nary Research Instit ute CAAS , L anz hou 730046) Abstract : 　Reverse genetics is a newly developed technique , and has been applied widely in life science research. The recent development of Reverse genetic technique was reviewed in the paper. the technique has been applied in Foot2 and2Mouth Disease Virus research ,and the relative progress was also reviewed. Key words : 　Reverse genetics 　Reverse genetic technique 　Full2length cDNA 　Foot2and2mouth disease virus

反向遗传学(Reverse Genetics) 是相对于经典遗传学而言的,因为经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律的,反向 遗传学则是直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象,与之相关的各种技术统称为反向遗传学技术( Reverse Genetic Manipulation) 。该技术目前已广泛应用于生命科学的各个研究领域, RNA 病毒研究的飞速发展更得益于此。以下介绍RNA 病毒的反向遗传学技术研究进展,并讨论其在FMDV 研究中的应用。 1 　反向遗传学操作技术的涵义

由于RNA 病毒在复制表达过程中, 不经历DNA 阶段,所以要进行RNA 病毒的分子水平上的操作,必须首先将RNA 病毒的基因组转换成cD2NA ,即得到病毒基因组的全长cDNA。然后克隆于合适的载体上,使之受控于强的转录启动子之下,在体外应用RNA 聚合酶转录系统,合成病毒基因组的RNA ,再用这些体外转录本转染宿主细胞,使之在宿主细胞内包装生成具有感染性的病毒粒子,从细胞培养物中回收病毒,得到感染性分子克隆。也可以直接用含有全长cDNA 的表达载体转染细胞,在体内转录生成具有感染性的病毒RNA。在此基础上,人们就可以根据自己的需要在DNA 水平上对RNA 病毒进行加工、修饰,从而研究病毒基因组的结构和功能,也可以研究病毒的转录、表达机制和致病机理等。上述在DNA 分子水平上对RNA 病毒进行操作,进而研究病毒的遗传规律和生物性状等的技术即是RNA 病毒的反向遗传学操作技术。 2 　全长cDNA 的克隆技术 反向遗传学操作技术是在cDNA 水平上进行操作的,因此生物基因组全长cDNA 的克隆就显得至关重要。在分子生物学技术飞速发展的今天,尤其是在真核生物基因组学领域,获得全长cDNA 的技术更是日趋成熟和多样化,原核生物的基因组结构比较简单,其全长cDNA 的克隆可借鉴于真核生物,目前真核生物基因组全长cDNA 的克隆技术常用的 方法有以下几种。 2. 1 　构建全长cDNA 文库,从中筛选含有全长cDNA 的克隆目前有多种构建cDNA 文库的方法可供选择但其基本原理都是相似的。即oligo ( dT) 结合的纤维素、磁珠或其他固体颗粒,分离纯化的mRNA (或含有poly (A) 尾巴的基因组) ,加入酶和反应底物直接进行cDNA 单链及双链的合成,然后再将cDNA 进行修饰。削平末端加上接头,磷酸化后,使之与合适载体相连。 2. 1. 1 　cDNA 文库固相构建法　这是ThomasRoeder 于1998 年在前人的基础上创新的一种比较好的方法[1 ] 。其原理如下: 5′端生物素化的oligi (dT) 252primer 连接在链霉亲和素包被的磁珠上,将总RNA 与磁珠混合后,通过磁性吸附,可进一步分离磁珠2mRNA 复合物,然后以oligo ( dT) 和随即引物为反转录引物DNA 第一链,随后再合成cDNA 第二链,用T42DNA 多聚酶削平末端,连上EcoRI 接头并磷酸化。最后用Not I 酶将cDNA 从磁珠上释放 下来,与载体相连接,获得高质量的cDNA 文库,cD2NA 的大小分布,以oligo (dT) 为引物合成的cDNA ,其大小从300bp～7 Kb ;以随机引物合成的cDNA ,其 大小范围在100bp 到7 Kb 之间。 2. 1. 2 　oligo2capping 法　针对5′端具有帽子结构的mRNA ,可以采取用细菌碱性磷酸酶(BAP) 去除无5′端mG保护的部分降解的不完整的mRNA 末端的游离磷酸基团,然后再用烟草酸性磷酸酶( TAP) 去除5′的mG结构,仅保留一个5′2 p ,合成一段r2oligo ,用T4RNA 连接酶连接到mRNA 去除了mG以及二磷酸基团的5′2 p 上,继而利用修饰的oligo (dT) 做反转录,并进行PCR 反应,最后克隆到合适的载体上,以建立cDNA 文库[2 ] 。 2. 1. 3 　CAPture 法　这是Ederly 于1995 年报道的一种比较有效的建立全长cDNA 文库的方法[3 ] 。其原理是利用帽子结合蛋白(CBP) 专门结合mRNA 的帽子结构,使得含有完整帽子结构的mRNA 被富集,以之为模板进行反转录, 然后用RnaseA 消化mRNA/ cDNA 杂种链,结果没有被CBP 结合的“部分降解”的不完整的mRNA ,以及虽然结合了CBP ,但并不完整的mRNA 都被降解掉。只有完整的mRNA 又有全长cDNA 第一链结合保护的那些mR2NA 得到保护,进一步纯化富集后建立cDNA 文库,其中含有全长cDNA 克隆的比例很高。但是,该方法需要大量mRNA。

2. 1. 4 　Cap t rapper 法　Carninci 等[4 ]发明了这种方法,其原理是用过碘酸盐标记mRNA 的帽子结构,反转录合成第一链cDNA 后,用Rnase I 除去RNA-DNA 杂合连中的单链部分, 这样非全长的RNA-DNA 杂合链就不含有生物素,然后用免疫磁珠法筛选出全长cDNA ,建立cDNA 文库。其中95 %的克 隆为全长cDNA。该种方法得率和产量较前几种方法增加10～50 倍,并且由于不需要做PCR 反应,可减少理论上的偏移和冗余性。 2. 2 　快速cDNA 末端扩增方法(RACE)RACE 是采用PCR 技术,由已知的cDNA 序列来扩增出完整的cDNA 的3′和5′末端的快速方法,又被称为单边PCR 和锚定PCR。现在已有现成的试剂盒供研究者选择使用,不同的RACE 试剂盒可能会采用不同的策略,但是其基本原理都是一致的。在得到目的基因的5′和3′末端特异性cDNA 以后,可以从两个相互重叠顺序的5′和3′RACE 产物中获得全长cDNA ,或者可以分析5′和3′端顺序,合成相应引物以扩增出全长cDNA。 2. 3 　利用穿梭载体获得全长cDNA 这是Kato 等[5 ]在oligo2capping 技术的基础上加以改进而发明的一种载体引物法。其最大特点是省略了PCR 和亚克隆等步骤。而且用这种方法得到 的全长cDNA 既能在体外表达,又能在哺乳动物细胞中表达。该方法的要点是构建一种穿梭载体,然后将此载体作成引物直接连在mRNA 的3′末端,做 反转录生成cDNA ,用所引入的限制性酶切位点消化后,使之自连,得到全长的cDNA。 3 　感染性分子克隆的构建 在克隆到RNA 病毒的全长cDNA 分子之后,可以通过合适的方法转染宿主细胞以回收具有感染性的病毒粒子,大体上有两种途径可达此目的。 3. 1 　将全长cDNA 克隆到含有强启动子的质粒载体上,在体外用RNA 聚合酶转录系统进行体外转录得到感染性转录本(RNA) ,再用转录产物感染宿主 细胞,回收感染性病毒粒子。这种方法中启动子的选择是很重要的,因为它将影响到体外转录本的产量和完整性。人们经常使用的启动子有: T7 , T3 ,Sp6 等强的启动子。在使用启动子的策略上,既可以把全长cDNA 序列克隆到含有这些启动子的载体中,又可以在合成cDNA 时将启动子的核心序列与cDNA 的5′端引物嵌合在一起,使得合成的全长cDNA 序列中含有启动子序列,然后再克隆到载体中。 3. 2 　直接用含有cDNA 的质粒(也必须具有强的启动子如CMV 启动子) 导入宿主体内,利用宿主的RNA 聚合酶及转录系统在体内发生转录生成具有 感染性的病毒RNA ,进而装配成病毒粒子。与体外转录相比该方法具有一定的优越性。因为所获得的RNA 是在体内产生的,对环境的依赖性降低了。另 外在体内产生的病毒RNA 更接近于宿主细胞的mRNA ,可使病毒基因组的表达不依赖于病毒的过程,尤其适用于研究那些不能在细胞内复制的突变 病毒RNA 编码蛋白的功能和定位。Van Gennip HG等[6 ]为了提高CSFV 的反向遗传产物的感染性,他们建立了一种稳定的猪肾细胞系,它能表达T7 RNA 聚合酶(SK6. T7) ,在用线性全长c DNA 转染细胞后,与体外转录RNA 相比,病毒的滴度可以提高200 倍,即使用环型c DNA 转染细胞,也能把病毒的滴度提高20 倍。而且,用这种方法得到的病毒与传统方法得到的病毒并没有什么区别。他们由此得出结论SK6T7细胞系可以作为一种有用的工具来回收CSFV 的突变体,对将来的工作极有价值。 4 　反向遗传学操作技术在RNA 病毒研究中的应用 目前,反向遗传技术在RNA 病毒的研究中已经得到广泛的应用并取得了很大的成就。对于正链RNA 病毒来说,该技术是最先得到成功使用的,已经获得了脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、烟草花叶病毒、芜菁黄色花叶病毒、登革病毒等的感染性分子克隆。相对而言,负 链RNA 病毒的反向遗传学操作技术就显得比较滞后。因为负链RNA 病毒裸露的基因组或由其cDNA转录而来的RNA 没有感染性。尽管如此,人们仍然 设法得到了一些负链RNA 病毒的感染性分子克隆,例如狂犬病毒、牛瘟病毒、新城疫病毒、水疱性口膜炎病毒、人副流感病毒等。其采用的策略主要有两种:其一是1989 年Luytjel 等[7 ]报道的方法,他们在体外转录体中插入来源于流感病毒基因组的调控序列。在体外利用转录本和纯化的病毒核蛋白以及聚合蛋白获得具有生物活性的核糖核酸蛋白复合物(RNP) ,在辅助病毒的参与下,转录本在导入细胞后得到复制和表达并包装成为病毒粒子。其二是利用 表达T7 RNA 聚合酶的重组痘病毒、表达RNA 复制和转录所需要的病毒蛋白的质粒以及含有病毒cD2NA 的质粒共同转染细胞,这样也可以得到感染性的 病毒。获得感染性分子克隆后,研究者根据其研究的目的,可采取不同的策略在DNA 分子水平上进行操作。总的来说体外操作的方法有基因敲除、基因缺 失、基因插入、基因置换、以及构建嵌和病毒等。反向遗传技术可以用于基因的克隆测序与定位[8 ] 。还可以用于研究DNA 的同源重组, 例如Sonoda E 等[9 ]用该项技术在DT40 细胞中研究了脊椎动物体细胞内DNA 的同源重组。此外,还可以在DNA 的分子水平上构建嵌合病毒以研究病毒基因组的基因 功能,例如,Dobbe JC 等[10 ]在马动脉炎病毒感染性cDNA 克隆的基础上,应用基因工程技术将其主要糖基化蛋白( GP5) 和膜蛋白(M) 用猪繁殖与呼吸综 合征病毒( PRRSV) 或鼠乳酸脱氢酶病毒(LDV) 的囊膜蛋白替代,研究了GP5 和M 蛋白转运到高尔基复合体上的过程及其在病毒装配中的作用,另外还确定了GP5 蛋白在受体识别中的作用。在体外对HAV cDNA 采取基因突变的策略,可能产生具有新的表型的病毒。小RNA 病毒的全长感染性cDNA克隆已经成功构建并用于研究决定病毒至病性的分析,例如在小RNA 病毒cDNA 中2A、3A 编码区,或者3′端非编码区进行插入突变的操作,结果产生的病毒子不能在宿主细胞中生长和增殖,而且对温度敏感。1988 年SVDV 的感染性cDNA 克隆成功构建,为了鉴定猪水疱病毒基因组中决定毒力的基因,Kanno T 等[11 ]在此基础上,从强毒株和弱毒株的cDNA 克隆制备了一系列重组病毒和定点突变病毒,最后证明基因组中决定毒力的基因在以下两个位点或其中的一个,一个是2842 位核苷酸,编码VP1 的132aa ,另一个是3355 位,编码2A20 位氨基酸。为了确定两个位点在决定毒力方面的相对重要性,分别在弱毒株和强毒株的这两个位点进行突变,并在猪体上验证。研究表明这两个位点都是决定毒力的位点,但是2A220 则是起主要决定的位点。总之,反向遗传学操作技术是一门很重要的学科,它的产生与发展必将有力的推动生命科学的发展。 5 　反向遗传技术在口蹄疫病毒研究中的应用 口蹄疫病毒( Foot2and2Mouth Disease Virus ,FMDV) 是一种单股正链RNA 病毒,它主要引起偶蹄动物发生口蹄疫,这是一种比较古老而顽固的传 染病,其流行范围之广,控制难度之大,以及对畜牧业之影响却是其他动物传染病所无法类比的。而且至今人类尚不能拿到一个切实可行的方法来控制消灭它,因此国际兽疫局将其列为A 类传染病之首。究其原因主要是人们对该病的致病机理、病毒毒力变异的机制、抗原的漂移性以及该病持续性感染发 生的原因等诸多问题尚不太清楚。因此一直拿不到一种安全有效的新型疫苗来控制口蹄疫,反向遗传学的兴起,对FMDV 的研究起了极大的推动作用, 目前人们不仅已成功获得了FMDV 的感染性分子克隆,而且应用于口蹄疫研究的各个领域并取得了令人瞩目的成就。 5. 1 　应用基因突变研究基因功能 为了研究FMDV RGD 序列在病毒感染过程中的作用,Leippert M 等[12 ]在基因组的全长cDNA 分子中,设计了13 个点突变,分别位于RGD 序列内部及其附近区段。在体外转录生成cRNA 后, 转染BHK221 细胞,结果发现在RGD 序列内部发生点突变的cRNA 转染细胞后,不能产生感染性的病毒粒子,在RGD 附近区段发生突变的cRNA 则能产生感染性病毒。为了进一步证明这些没有感染性的病毒只是由于在细胞吸附位点上有缺陷, 他们又将在RGD 序列内部发生点突变的cRNA 与表达有野生型P1 蛋白的cRNA 共转染细胞,结果产生有感染性的病毒粒子,因而也证明了FMDV RGD 序列在病毒吸附过程中具有重组作用。 5. 2 　构建嵌合病毒研究基因变异与毒力之间的关系 Sa2carvalho D 等[13 ]构建了一种嵌合病毒,即把两个不同血清型的O1 株编码核衣壳蛋白的cDNA序列插入A12 株的感染性cDNA 分子中,构建成一 种新型的杂种病毒,它能表现出原来亲本的基因型,通过不断增加核衣壳蛋白基因的长度比例,研究并分析嵌合病毒在细胞中的生长情况及其毒力的变激酶活性( PKR) 。Chinsangaram J 等[18 ] 为了验证这一推测,用PKR 的抑制剂22氨基嘌呤处理猪和牛细胞,与没有处理过的细胞相比,病毒的产量提高了8. 8～11. 2 倍;另外用FMDV 感染通过基因敲除鼠得到的缺失Rnase L - / - 或PKR - / - 的胚胎干细胞,证明PKR 具有抑制FMDV 复制的作用。

参考文献 1 　Thomas Roeder. Nucleic Acids Research , 1998 , 26 (14) : 3451～3452. 2 　Maruyama K,Sugano S. Gene , 1994 , 138 : 171～174. 3 　Ederly I , Chu IL , Sonenberg N , et al. Mol Cell Biol , 1995 , 15 :3363～3371. 4 　Carninci P , Westover A , Aishiyama Y, et al. DNA Res , 1997 , 4(1) : 61～66. 5 　Kato S , Sekinev S , Oh SW, et al. Gene , 1994 , 150 :243～250. 6 　Van Gennip HG,van Rijn PA , Widjojatmodjo MN , et al. J VirolMethods , 1999 , 78 (1～2) :117～28. 7 　Luytjel W, Krystal M , Enaml M , et al. Cell , 1989 , 59 : 1107～1113 . 8 　Hecard Y, Berjeaud JM ,Cenatiempo Y. Curr Microbiol , 1999 , 39(5) :265～269. 9 　Sonoda E , Morrison C , Yamashita YM , et al. Philos Trans R SocLond B Biol Sci , 2001 , 356 (1405) : 111～117. 10 　Dobbe JC , van der Meer Y, Spaan WJ , et al. Virol , 2001 ; 288(2) :283～94. 11 　Kanno T , Mackay D , Wilsden G, et al. Virus Res , 2001 , 80 :101～107. 12 　Leippert M , Beck E , Weiland F , et al. J Virol , 1997 , 71 : 7400～7412 . 13 　Sa2carvalho D , Rieder E , Bast B. J Virol , 1997 , 71 (7) : 5115～5123. 14 　Almeida M , Rieder E , Chinsangaram J , et al. Virus Res , 1998 ,55 (1) : 49～60. 15 　Beard C , Ward G, Rieder E , et al. J Biotechol , 1999 , 73 :24～249. 16 　Ward. G, Rieder E , mason PW. J Virol , 1997 , 71 : 7442～7447. 17 　Chinsangaram J , Mason PW, Grubman MJ . Vaccine , 1998 , 16(16) : 156～22 18 　Chinsangaram J , Koster M , Grubman MJ . J Virol ,2001 , 75 (1) :5498～5503.