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    比较基因组杂交技术在肿瘤研究中的应用

    相关实验：比较基因组杂交技术在肿瘤研究中的应用实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    Ham F10 培养基 胎牛血清 L-谷氨酰胺 青霉素 植物血球凝集素 秋水仙素 KCl 甲醇 冰乙酸 DNA 聚合酶 I DNase I dNTP 反应混合物 dTTP 生物素-16-dUTP 地高辛-11-dUTP 人 Cot-1 DNA SSC TNT TNB 亲和素-FITC 羊抗地高辛-TRITC

    步骤

    3 . 1 中期染色体的制备 1 . 将 Im L 肝素抗凝血与9mL Ham F lO 培 养 基 （其 中 含 1 0 % FCS、 1 % L- 谷氨酰胺、 1 % 青霉素/链霉素、 1 . 5 % 植物血球凝集素）共 同 在 5 % CO2 37°C 培 养箱中培养72h 。 2 . 用 0. ly g /m L 秋水仙素阻断细胞有丝分裂，作 用 30min。
    3. 150g 离心 细 胞lOmin。弃上清。 4 . 加 入 IOmL KCl重悬细胞团块，室温下放置20min。 5. 150g 离 心 lOmin。弃上清。 6 . 加 入 IOmL甲 醇 ：冰 乙 酸 （3 : 1 ) 固定细胞，注意小量缓慢加入并不断 混勻。 7. 150g 离 心 lOmin。弃上清。重复步骤6。 8. 150g•离心lOmin。弃上清。 9 . 用 约 Im L 甲 醇 ：冰 乙 酸 （ 3 : 1 ) 重悬细胞。 10. 用巴斯德吸管取1 或 2 滴细胞悬液，滴到乙醇处理过的载玻片上。 11. 立刻滴加数滴甲醇：冰 乙 酸 （3 : 1 ) 后固定标本。 12. 用相差显微镜检查中期染色体分裂相质量（见 注 释 3)。 13. 染色体标本在室温下过夜风干，可在一20°C干燥条件下保存。 3. 2 DNA标记 1 . 将 Ijug DNA、 dNTP、 0. 5jaL dTTP、 IjuL 地高辛或生物素标记的 dUTP、 3 , DNA 聚 合 酶 I/DNase I 、 O〜 IjuL稀 释 的 DNase I (调整浓度以获得 理想的片段长度）混合。加 ddH20 至 3(V L 。 2 . 在 15°C条件下孵育1. 5〜 2h。 3 . 在 70°C条 件 下 15m in 以灭活酶。 4 . 通 过 EB 染 色 的 1 % (m/V) 琼脂糖凝胶电泳观察5 ^ 标 记 DNA。 5 . 用 紫 外 透 射 反 射 仪 观 察 D N A 片 段 长 度 ，最 理 想 的 D N A 条带长度为 500〜2000bp (见注释 4)。 3 . 3 杂交与洗脱 1. 混 勻 IO1 LtL标记肿瘤DNA (常用生物素标记） 、 IOj^L 标记正常对照DNA (常用地高辛标记）和 未 标 记 的 Cot-1 DNA。 2 . 在上述的样品中加入0. 1 倍 体 积 的 3m o l/L 乙酸钠和2 倍体积的乙醇沉淀 探针混合物， 12 OOOg离 心 30min。 . 3. 弃上清并气干探针沉淀。 4 . 用杂 交 液 溶 解 探 针 沉 淀 。 5 . 将中期染色体标本在72°C水 浴 中 于 7 0 % (W V ) 甲酰胺/2X SSC 中变性 6min (见 注 释 5)。 6 . 将变性的标本在梯度乙醇（7 0 % 、 9 6 % 和 1 0 0 % ) 中脱水。 7 . 将 D N A 探针混合物在80°C变 性 lOmin。
    8 . 立即 将DNA探针混合物滴加到中期染色体标本上。 9 . 加 盖 玻 片 （18mmX 18mm)，用橡皮泥封片。 10. 在 40°C湿盒中杂交2〜3 天 。 11. 小心揭去盖玻片。 12. 在室温条件下的2X SSC 中 洗 5min。 13. 在 45°C条件下的0. IX S S C 中 洗 3 次 ，每 次 5min。 14. 在室温条件下的T N T 中 洗 5min。 15. 在 标 本 上 滴 加 IOOjuL TNB，加 盖 玻 片 （ 24mm X 50mm) ，预孵 育 IOmin0 16. 在 标 本 上 滴 加 IOOiLtL含亲和素-FITC (1/200)和羊抗地高辛-TRITC (1/50)的 T N B 溶 液 ，加 盖 玻 片 （24m m X 50mm) ，置 于 湿 盒 中 在 40°C 孵育 60min (从此步骤起标本注意避光)。 17. 在室温条件下的T N T 中 洗 3 次 ，每 次 5min。 18. 在室温条件下的2X SSC 中 洗 5min。 19. 标 本 在 梯 度 乙 醇 （7 0 % 、 9 6 % 和 1 0 0 % ) 中脱水。 20. 在标本上滴加25p L 含 D A PI的抗萍灭剂，加 盖 玻 片 （24m m X 50mm) ， 橡皮泥封片。 3 . 4 荧光显微镜及图像分析 CG H 要求有三个单通道滤光片的荧光显微镜。 DAPI (蓝色）用于识别染色 体 ， FITC (绿色）用于识别杂交的肿瘤DNA， TRITC (红色）用于观察杂交的 正 常 DNA。 1 . 寻找红绿荧光信号均匀、背景低、分 散 良 好 的 中 期 染 色 体 分 裂 相 （见注 释 6)。每个中期染色体分裂相采集三张图（DAPI、 FITC 和 TRITC)。 2 . 用 8〜12个细胞中期染色体的平均比值与相应染色体绘图得出“相对拷 贝数核型”（图 2)。偏 离 1.0的显著性最好结合9 5 % 可信区间进行分析， 9 5 % 可 信区间根据平均比值绘出图像（见 注 释 7)。 4 . 注释 1 . 当使用组织切片从肿瘤细胞提取DNA时 ，混 入 正 常 细 胞 （间质或浸润淋 巴细胞）会影响结果。当样本中的正常细胞超过2 5 % 时 ，则要根据肿瘤的倍体 决定是否必要采用显微切割技术[23]。显微切割可以手工操作也可以借助于先进 的激光显微切割设备[24,25]来 完 成 。然 而 后 者 只 能 获 取 有 限 的 细 胞 （即 DNA)， 必要时要进行通用PCR扩增[26’27]。这些技术耗时、昂贵，而且实验人员必须进
    行较好的对照实验以确保CG H 结果的可靠性。另一种方法是进行细胞分选（如 抗体连接磁珠法或流式细胞分选） ，可 以 选 出 （或分离出）肿瘤细胞或从样本中 去除炎性细胞。 2 . 新进展：目前多个实验室正在开展一项新技术—芯 片 CGH。使用中期 染色体进行杂交不能检测基因组中较小的片段（小于1〇 〜20Mb)。芯片技术可 以对基因组DNA拷贝数的改变进行更细致的研究，并 可 以使用cDNA分析基因 表达情况。目前为止大多文献采用cDNA芯片进行研究^ 〜 33」。最 近 ， Pinkel小 组 和 Albertson小组发表了关于基因组DNA芯片的论文，描述一种测定位于20 号染色体的一套克隆拷贝数突光比值的方法。这一技术是为检测哺乳动物复杂基 因 组 DNA序列的获得或丢失提供高分辨率的方法[34’35]。芯 片 C G H 可以对肿瘤 遗传性畸变进行更精确地分析，并可对关键基因进行更精确地定位。另外，在临 床应用性研究中可以确定特定疾病相关基因的状态。更加详细的讨论可见其他 论著[36’37]。 3 . 用 于 C G H 的高质量中期染色体标本应该满足以下几点：大量中期染色 体 、较少的细胞质残留（过多的细胞质会产生背景并影响变性效果） 、最少的染 色体重叠。此外，染 色 体 要 长 度 适 当 （400〜550条带）和不含分离的染色单体。 最后，为了得到理想的带型，相差显微镜下观察到的染色体不要太亮应该发 暗[28]。开始正式CG H 实验之前要试用几批来自不同供者的染色体片子，因为它 们的杂交效果会有很大差异。也可以选择商品化的制备好的染色体标本。然而在 正式使用前仍需进行预试验，质量未必优于实验室自制的标本（如上所述的方法 制备)。 4 . 当生物素和地高辛标记的dU T P 掺 入 到 DNA (间接标记）时 ，杂交后需 要用荧光素耦合的抗体（分别用亲和素-FIT C 或羊抗地高辛-TRITC) 进行检测。 荧光素直接耦合的dU T P 在染色体上的杂交信号弱而均勻。肿瘤组织和正常组 织 D N A 的标记片段长度应在同一范围内，限制在500〜2000bp。 5 . 变性时间是可变的，应该根据每批制备的中期染色体进行调整。如果中 期染色体标本变性时间过长，荧光信号会很强但是DAPI带型会很差，不能排出 正确的核型。反之，如果标本变性不充分， DAPI带型好、易辨认但荧光信号太 弱且呈颗粒状。因 此 C G H 实验的诀窍之一在于掌握二者的平衡。 6. CGH 实验中挑选好的中期染色体分裂相进行图像分析是至关重要的。整 个中期染色体分裂相的荧光信号应该强而均匀。应注意避免出现较多的重叠染色 体 、过长或过短的染色体。背景要低，局部背景过强可能是残留的细胞质造成 的。保持显微镜透视野的均一性是十分必要的，不一致会造成镜下的大批假象。 而且， CG H 实验中如果Cot-1 DNA 阻断效果良好，好的中期分裂相中着丝粒区 会呈现为暗的区域。因为着丝粒区域包含的高度重复序列的长度存在很大的个体 差 异 （因此在肿瘤和正常细胞之间也存在很大差异） ，会 影 响 CG H 结果的分析。
    这些重复序列在全基因组范围内也都有不同程度的存在。 Cot-1 D N A 阻断不充 分会降低敏感性。 7 . 目前有两种方法判断相对拷贝数核型分析的结果。一些研究者使用固定 的比值限制，如 0.85/1.15或 0.75/1. 2 5 , 这 取 决 于 杂 交 的 质 量 。另一些学者 更倾向于使用9 5 % 可信区间，该方法考虑到了信号质量对结果的影响。根据后 者的定义，偏离正常被解释为丢失或获得是指参照9 5 % 可信区间，平均比值明 显低于或高于1.0。另 外 ， lp 32-pter、 16p、 19p /q 和 22q 的红绿荧光比值有时 并不可靠，常会导致假阳性判断[3°]。总的来说，如果只有低度的获得或丢失， 这些染色体区域不会计入C G H 曲线的判断。

    来源：丁香实验

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