PCR技术在骨肿瘤研究中的应用

1、在骨肿瘤发病机理研究中的应用

骨恶性肿瘤是多种癌基因多阶段多途径协同作用的结果，到目前为止，发现与骨恶性肿瘤密切相关的癌基因有K-ras、c-fos、proα-1、proα-2、c-sis、c-raf、 c-myc、met、mdm2，抗癌基因有Rb、P53、P16等。发现的癌基因已有100多个，抗癌基 因有8个，它们当中究竟还有哪些与骨恶性肿瘤发生发展有关，仍有待于进一步研究。 PCR技术是一门快速诊断技术，尤其是PCR相关技术的发展，给分子水平的研究带来了 一场革命。使研究的效率大大提高。

①骨恶性肿瘤中癌基因突变、缺失、重排的研究 癌基因突变重排常导致肿瘤的发生，因此检测癌基因的改变对研究骨肿瘤发生机理具有重要意义。传统的方法是提取 DNA，走电泳，转移到NC膜上，再用标记的探针进行杂交，检测缺失、重排、突变。方 法比较繁琐，放射性同位素对人体亦有害，而PCR技术利用一对引物就可以把待检的 DNA片段扩增出来，再利用RFLP技术或SSCP技术就可以检测出有无重排、缺失、突变，既方便快速，又对人体没有任何伤害。

②骨恶性肿瘤中癌基因扩增与表达的研究 特异性癌基因的扩增与高表达常导致骨肿瘤的发生，找出这种特异性癌基因对骨恶性肿瘤的发病机理的研究具有重大理论意义，同时，也给临床诊断骨肿瘤带来特异性指标。传统的研究方法首先要提取DNA或RNA进行紫外定量，并用尿素变性电泳鉴定 有无降解，然后再转移或打点至NC膜上，用相应的标记好的探针进行杂交，放射自显影，最后进行灰度扫描来定量，这种研究方法最快也得需要二周时间，而定量PCR技 术则只需50-80ng的模板DNA或RNA，扩增25个循环，就可以从计算机中打印出结果， 得出原始模板当中某个癌基因的拷贝数，可以直接判断出有无某种癌基因的扩增与高表达。运用PCR方法筛选这种特异性癌基因，方法简便，快速，在较短的时间内可以完成相当大的工作量。
 
③骨恶性肿瘤特异性抗原基因的筛选研究　十多年来对骨恶性肿瘤细胞株的研究表明，骨恶性肿瘤中存在一些特异性抗原与相关性抗原，并且已经研制成了一些特异性单克隆抗体，但是到目前为止，尚未有人筛选出骨恶性肿瘤特异性抗原的基因，传统的研究方法是首先从大量肿瘤组织中提取 肿瘤抗原，然后免疫动物，取脾脏等与杂交瘤融合，再从阳性克隆中筛选特异性的单 克隆抗体。这种单抗，运用于人体仍然可引起免疫反应，故在九十年代开始，已进行人源性单抗的研制，尤其是丝状噬菌体呈现技术的运用，使得人源性全套抗体库的构建获得成功，避免了免疫动物等一系列繁琐途径。全套抗体库的构建首先利用mRNA。直 接反转录成cDNA，构建成cDNA文库，根据抗体可变区基因两侧序列的保守性，设计与之结合的一对引物，以cDNA为模板，PCR扩增出抗体可变区重链和轻链基因，用接头 DNA连接起来，再与丝状噬菌体基因Ⅲ5'端重组，表达于噬菌体表面，然后将噬菌体抗体文库通过表面结合有特异性肿瘤抗原的亲和柱，就可以筛选出相应的人源性单克 隆抗体。然后对单抗进行部分氨基酸序列分析，反推出数个寡核苷酸，以这几个寡核苷酸为引物，运用AP-PCR方法直接筛选出相应的抗原基因。

2、在骨肿瘤转移机理研究中的应用

①nm23-H1基因与骨恶性肿瘤转移相关性研究　nm23-H1基因是转移抑制基因，它已在多种肿瘤中发现与转移有关，但在骨肿瘤 中结果如何未见报道，作者拟对18例骨恶性肿瘤标本运用定量PCR仪，检测了nm23-H1 表达程度。

引物P1为:5'GGGACGCAACTGTGAGCGTACCTTC3'；

引物P2为:5'GATTGGATCCTCATTCATAGATCCAGTTCTGACC3'

利用带有荧光信号的通用接头把荧光信号标记在P15'端，运用定量PCR仪，以正常肝脏组织总RNA为模板，进行一系列倍比稀释，运用RT-PCR一步法直接扩增。结果表明，当模板为80ng时，25个循环后，扩增产物量与扩增指数呈线性关系，因此，当模板采用80ng时，利用定量PCR仪可检测出原始模板中nm23-H1拷贝数，从而可以判断出 nm23-H1的表达程度。(研究表明，nm23-H1与骨恶性肿瘤转移有关)同理，可以运用定量PCR仪进行多种癌基因的检测，从而筛选出与转移相关的癌基因。

②骨肿瘤转移基因的筛选研究　基因直选法是建立在分子杂交和PCR技术基础上的一项基因分离技术，可以运用于骨肿瘤转移相关基因的筛选。基本原理是利用人的基因组区做诱饵，从骨肿瘤cDNA 文库中钓出其互补区，然后进行PCR反应，使钓出的CDNA大量扩增，再将CDNA克隆进 行直接测序分析，然后用定量PCR方法检测临床转移与非转移标本，看表达相差的程 度，来进一步证实是否为骨肿瘤转移相关基因。这种方法特别适用于正常情况下表达 很低的转录单位相应基因的分离。总之，PCR技术是一门非常有用的技术，掌握它可以给基础研究及临床诊断带来难以想象的收获，尤其是PCR相关技术的发展给基础研究 带来了一场新的革命，PCR技术必将会获得越来越广泛的应用。