人绒毛外滋养细胞分离与培养

滋养细胞生物学功能的正常行使是维持正常妊娠的关键环节。胚胎着床后，滋养细胞分裂、增殖，分化形成生物学特性明显不同的EVCT和绒毛滋养细胞（villous cytotrophoblasts，VCT）。

它们是母胎界面唯一与母体免疫系统直接接触的胎儿细胞，在胚胎植入、母胎免疫耐受过程中发挥重要作用。

作为滋养细胞分化的终末细胞，EVCT体外培养后可贴壁，由最初的卵圆形逐渐伸展成纺锤形、星形或多角形；EVCT可迁移、聚集，但不融合，增殖能力低。

表达角蛋白7，不表达波形蛋白。HLA-G仅表达于EVCT，可作为其筛选标记，进一步完善滋养细胞的评价与鉴定。

人绒毛外滋养细胞分离与培养的基本原理是EVCT具有侵袭能力，在子宫蜕膜深部聚集形成孤岛，与子宫蜕膜细胞接触最为密切，是母胎免疫微环境的重要组成部分。

从蜕膜中挑选出绒毛组织，通过酶消化后研磨过滤，并进行密度梯度离心，根据细胞的密度吸取40％ 密度层初步获得滋养细胞，通过不同时间短期培养进一步纯化EVCT。

然后根据细胞的形态、表型及功能特点，利用免疫组织化学或荧光抗体同时标记细胞表面抗原进行流式细胞术分选等技术方法对细胞进行鉴定、分离和纯化，为深入探讨滋养细胞生物功能打下基础。

试剂：

PBS溶液、D-Hanks溶液、RBC裂解液

DMEM／F12培养液、胎牛血清、胰蛋白酶

胶原酶IV型、DNA酶I型、纤维连接蛋白（FN）

IV型胶原、Matrigel、Percoll原液、抗生素

仪器：

眼科剪，镊子，不同规格筛网（80目，300目）

各类培养皿，注射器柄，不同规格塑料离心管

1.5 mlEP管，吸管，台式冷冻离心机

磁极及磁珠分选柱，CO₂孵育箱，水浴摇床，流式细胞仪

人绒毛外滋养细胞分离与培养的基本步骤可分为以下几步：

1．试剂配制

（1）IV型胶原工作液：采用0.25％ 冰醋酸溶解IV型胶原，4 ℃过夜使其充分溶解，终浓度为2.0 mg／ml。使用时按6～10 μg／c㎡包板，4 ℃过夜。包被有IV型胶原的细胞培养板可采用紫外线照射过夜灭菌或者75％ 乙醇冲洗灭菌。

（2）FN工作液：将1 mg FN干粉溶解于1 ml无菌蒸馏水中，室温放置30分钟使其自然溶解，储存浓度为1 mg／ml。分装成20 μl／管，保存于-70 ℃。

20 μl FN溶液溶入1 mlFD培养基（工作浓度为20 μg／ml），倒入直径为35 mm皮氏培养皿中，室温下孵育45分钟后，弃培养基。

包被好的培养皿即可使用或保存于-20 ℃，但不超过2周。

2．新鲜蜕膜组织用1xPBS洗三遍，去除血凝块和胎膜，获得绒毛组织用眼科剪剪成1 mm3碎块。

3．加入0.25％ 胰蛋白酶与0.1％ DNase I于37 ℃水浴轻柔振荡消化5分钟后吸出消化液并弃之。

4．剩余组织再加入0.25％ 胰蛋白酶与0.1％ DNase I继续于37 ℃水浴消化10分钟，吸出消化液，再加入10％ 小牛血清终止消化。如此反复共消化3～4次，收集所有上清液。

5．取富含滋养细胞的消化上清，依次经80目和300目筛网过滤，收集滤过液体，300 g离心10分钟，弃上清。

6．将细胞团重悬后铺于不连续Percoll梯度液上（10％～70％，每10％ 一个梯度），1000 g离心20分钟。

7．吸取40％ 密度层的细胞（p＝1.048～1.062 g／ml）即为滋养细胞，洗涤后加入含10％ 胎牛血清的DMEM高糖培养液。

8．调整细胞密度为5x10／ml，种植于预先包被IV型胶原（或者FN或者Matrigel）包被的培养板，贴壁培养10分钟，去除易贴壁的成纤维细胞。于37 ℃、5％ CO₂孵育箱中培养24小时后方可初次换培养液。

9. 24小时后在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态。EVCT可以迁移、聚集，但不融合，增殖能力弱。

10．根据波形蛋白阴性，CK7阳性这些特征对所获得的细胞进行免疫组织化学鉴定。

1．根据实验室的实际条件可用1 mg／ml胶原酶IV和0.1 mg／ml DNase I对绒毛组织进行消化。

2．EVCT增殖能力较弱，传代次数过多易使细胞的某些生物学特征丢失，所以研究中降低培养细胞的传代次数很重要。

3．EVCT与VCT均表达CK7，不表达波形蛋白，可以用c-erbB-2免疫组织化学法对EVCT（c-erbB-2阳性）和VCT（c-erbB-2阴性）区分鉴定。

要得到纯度高的EVCT，需要标记人anti-HLA-G抗体，应用流式细胞术分选EVCT。