人滋养细胞原代培养讨论

我最近在做人滋养细胞原代培养，先是用的胰酶消化法，percoll和不用percoll都做了，接种到培养瓶（25ml）里的细胞的覆盖率不到30%，可怜，长了n长时间，也就那么几个细胞。老板建议用组织块，不知道会怎样。

胰酶消化法：

1.标本少。由于我们取材都是6~8周的绒毛，个人感觉很少，而且那个绒毛连在妊娠囊上，很难的分开，我一般都是用镊子嵌夹下来的，不知道文献中的“取蜕膜和羊膜之间的绒膜，眼科剪仔细去除中间轴心部分，剪下细小绒毛”是怎么做到的？

2.损耗大。我一开始是用percoll的，在percoll之前，重悬液中我还可以看到不少的细胞，但是percoll后却看不到传说中的云雾状中层，找了一下原因：细胞太少。percoll和胰酶消化都很消耗细胞。

为解决这些问题，我用了3个标本一起做，省去了percoll步骤。结果细胞被污染了。可能是取材的无菌不够严格。

丁香园网友dongwp认为：

1、“6~8周的绒毛”你总的取用的材料有多少（克）？因为关系到后面获得的细胞数。

2、“眼科剪仔细去除中间轴心部分”，因为此部分为血管延续的部分，有大量的细小血管。这样的取材肯定比你“用镊子嵌夹下来”得到的组织要多。

3、把你的消化情况解释下，便于战友分析、建议。

丁香园网友liwei3278认为：

我也在做人滋养细胞原代培养，培养的细胞量还行，我个人的体会就是消化要把握好，我们用０。２５％的胰酶消化。虽然组织少，但细胞特别多。

丁香园网友seahawk_l认为：

liwei3278,你取多少绒毛组织消化呢？消化时间多少？我在文献上查到的消化时间差异很大，我自己用的是5分钟。取组织大约3x3平方毫米，消化离心后细胞成团，用力吹打后部分成单细胞，还有一些大组织块粘在一起吹不开（但我消化之前是尽量剪碎的），感觉细胞不是很多。是否与所取组织太少有关？

我还感觉完全的单细胞悬液细胞长的并不是太好，一些较小的细胞团反而长的好一些，不知是否有同感？

另你用的培养基是什么？我用的IMDM加GIBICO血清。有时第二天看细胞贴壁很多，圆圆的或稍变形，但一周后看仍然是这样，变化不太大，别人说五天长满，我的十五天都长不满，这是什么原因？

丁香园网友路路通认为：

我是liwei3278,我们也是取的孕6-8周妇女的绒毛，一般洗完剪碎之后也就剩不到2毫升，消化25分钟，在消化过程中应反复吹打，细胞变圆即可，不必等它浮起来，我觉得细胞量与消化关系特别大，与组织量关系不大，另外年龄小\孕周小的细胞状态更好。我们用的培养基是DMEM加胎牛血清，细胞状态对贴壁的好坏很重要。

丁香园网友crystal_1303认为：

我最近在做组织块，在第五天长出来了，现在已经是第十三天了，还没有传代，感觉比消化法让人有信心一些，呵呵，至少有细胞阿。我在第五天看到细胞长出来后，整天感觉with hanger in my mouth，呵呵，monica的话。

TIPS: 要用塑料的培养瓶阿，我的玻璃的已经第十天了，连个细胞的影子都没见到。

“眼科剪仔细去除中间轴心部分”如果这样做的话，工程很庞大阿，一个绒毛干就那么一点的小阿，尤其我们实验室的超净台的玻璃业不太清楚，恐怕分完一个，我的眼睛也挂了吧。呵呵

另外我对liwei3278也就是路路通的有一点疑问哦。你能不能详细描述一下你把绒毛剪碎的过程阿？还有你那句“细胞变圆即可”是什么意思，你是在消化过程，边消化边看吗？但是时间只有5分钟啊，不知道来不来得及？

丁香园网友湖南辣椒提问：

我现在也在做滋养层细胞培养，每次消化后都很粘，根本就不能通过200目的筛网，有没有什么解决的方法？谢谢啦。还有就是DNA酶是用什么稀释的：三蒸水还是平衡溶液？

丁香园网友crystal_1303认为：

噩耗：我的细胞在养到第十六天，眼看就要传代的时候，发现污染了，细胞逐渐固缩，死亡了。整个瓶底都是圆形的东西，不知道是什么。问了资深的实验室老师，说可能是标本有问题。看来这样只能普篇撒网了，看能不能收获几瓶没污染的。

ps:大家来讨论一下，如何取标本才能减少污染？

我是用离心管装pbs在放到有冰的保温桶里面，去人流室去的，一般情况下，让人流室的老师在绒毛还在吸头上的时候，用无菌的钳子夹着放到离心管里面。但是，由于我们不能完全保证所取得这个孕妇的绒毛是否无菌，所以也只能普遍撒网了。

另外湖南辣椒的可能是消化时间的问题，这个好像要自己摸索，我看了几个人的时间都很不相同阿。dna酶应该是用平衡液吧

丁香园网友woniudetiankong认为：

我是用的胰酶（15min）消化法，有加Dnase(15min)。

问题：

1.细胞数量很多，但是贴壁12小时后，基本上全部的细胞都浮起来

为什么会这样呢？既然是已经贴壁了，怎么又浮起来了呢？

2.细胞碎片很多，如何去处？

3.经常是细胞刚接入瓶中后，培养液颜色很快变得很红，明显偏碱，是破碎细胞太多的原因么？

4.Dnase浓度及消化时间一般为多少阿？