原代软骨细胞分离培养

以兔软骨细胞为例：
①一般根据实验要求，选取不同年龄组的兔子，实际上兔子的年龄越小越好，毕竟幼体组织的活力要高于成体组织的活力，耳静脉空气注射法处死后,无菌条件下分离后肢关节软骨和肋软骨，剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜，放入盛有PBS液的培养皿中。
②将分离得到的软骨组织剁碎成0.3-0.5mm的组织块，移入25cm2培养瓶，用含双抗的PBS液冲洗软骨3次。
③加入软骨体积10-15倍的0.25%胰蛋白酶，37℃消化１－２小时后终止消化。
④加入0.02%II型胶原酶，37℃消化17-20小时（也就是过夜），这是我们实验室长期摸索出来的方法，虽然比较浪费时间，但是获得的细胞活力确实不错。
⑤在倒置显微镜下观察，当游离出单个细胞后，加入DMEM培养液将II型胶原酶稀释终止消化。
⑥将细胞团吹打成单个细胞后用200目滤网过滤，收集滤液，1500r/min离心5min。
⑦弃上清，加入DS培养液重悬，0.2%台盼蓝染色，活细胞率大于90%，CO2培养箱孵育。