分离培养细胞

骨豁肌源性成肌细胞能够培养从几种成年动物骨骼肌分离的成肌细胞。在培养条件下，成肌细胞仍继续表达一些分化特征。成肌细胞称卫星细胞，分化早期的步骤与骨骼肌很相似。成肌细胞在培养底物上增殖和迁移，然后成直线排列，最终融合形成多细胞核肌管。在单肌纤维培养，按整块取骨骼肌。用胶原蛋白液孵育，以消化结缔组织。然后，轻微机械性研磨使肌纤维分离。可从骨骼肌分离出肌纤维及其卫星细胞。在添加 20%（fetal bovine serum， FBS) 的 Ham's F12 培养中，原代细胞容易生长。在不改变培养条件的情况下，这些细胞增殖和分化，融合形成多个细胞核的肌管。这证明培养的细胞具有成肌性

一、材料

无菌 

1. 转运培养液：Ham F12（Seromed 08101），不含 NaHCO₃，含有 20 mmol/LHEPES(Serva 25245),75 ml

2. 生长培养液: Ham F12, 添加 20%FBS（Gibco 011-06290），200 ml 

3. 链霉菌蛋白酶液：0.15% 链霉菌蛋白酶（Sigma P-6911）、0.03% EDTA（Merck 8418）、20IU/ml 青霉素和 20ug/ml 链霉素（0.4%Eurobio PES300），用 Ham F12 或 D-PBSA 配制 100 ml 

4. D-PBSA：100 ml

5. 尼龙网：孔径为 100um

6. 手术刀 

7. 锋利的长剪刀 

8. Petri 培养皿：直径为 90 mm，用于切组织块 

9. 培养皿：25 cm²，4 个 

10. 20 ml 离心管或一般容器，5 只 

非灭菌 

1. 血细胞计数板 

二、操作步骤：

1. 分离：用手术刀切除活检组织块上的非肌性组织，然后用 D-PBSA 浸洗。

2. 称重前，与肌纤维平行将切除活检组织切成片，用 D-PBSA 冲洗。

3. 将组织片平行放入 Petri 培养皿盖内，切成较薄的柱状组织块，然后切成 1 mm³小块。不要挤压组织。也可在试管内用长剪刀将组织简称小块，应避免挤压组织。

4. 用 D-PBSA 浸洗组织块，静置后吸取上清液。

5. 在 37℃ 条件下，用链霉菌蛋白酶液消化组织块 1 h。每 1~3 mg 组织块用 15 ml 链霉菌蛋白酶液。每间隔 10~15 min 轻轻摇晃试管。

6. 孵育后用吸管研磨组织块。由于越来越多的细胞分离下来，培养液会逐渐变得浑浊。

7. 让组织块沉到试管的底部，形成沉降的组织块（P1）和上清液（S1）。

8. 用孔径为 100um 的尼龙网将 S1 滤入 20 ml 离心管。轻轻摇晃或用吸管吹打上清液，使细胞混悬。

9. 离心（350 g，8~10 min）后，吸取上清液。

10. 准确加入 10 ml 生长培养液，用带有橡皮吸头的吸管很轻微地混悬细胞。然后，用血细胞计数板计数细胞。

11. 用生长培养液稀释细胞悬液，以约 1.5x10⁴个/ml 的细胞密度将细胞接种于培养瓶。从 1 g 健康供体活检组织约获得 1~2x10⁵ 个细胞。

12. 将 15 ml 消化液加入 P1，在 37℃ 水浴中孵育组织块 30 min，并定时摇晃。

13. 用吸管吹打细胞悬液，使细胞分散。然后，用尼龙网过滤细胞悬液。用 20 ml 生长培养液浸洗滤网。

14. 离心（350 g，8~10 min）后，计数细胞，按上述方法接种细胞。

15. 将培养瓶移入湿润的培养箱，在 37℃ 和 5%CO2 的条件下培养细胞，

安全提示
在扔入垃圾前，应该用次氯酸盐处理剩余组织和使用过的试管、吸管、培养皿。

维持培养 

16. 接种后 24 h 很轻微地换培养液，以后每 3~4d 换液 1 次。细胞主要向着分化生长。人成肌细胞的生长分 3 期，培养后 4~6d 增殖达高峰；8d 作用排列成 行；10~12d 细胞融合形成肌管增多。然而，必须记住一些细胞可能分化较早，绝大多数细胞分化时一些细胞仍处于增殖状态。

传代培养 

17. 将少量 EDTA 轻轻注在细胞上面后立即吸取。

18. 加入 0.25% 胰蛋白酶液，足以在细胞上面形成一薄层。

19. 当细胞去附着时，加入 5~10 ml 完全生长培养液，用吸管很轻微地吹打细胞，然后离心（350 g，10 min）。

20. 计数细胞，按一定密度种植细胞。

1. 在扔入垃圾前，应该用次氯酸盐处理剩余组织和使用过的试管、吸管、培养皿。                                     
   

2. 培养液需要在无菌的环境下才能打开，避免污染。

1. 成肌细胞称卫星细胞，分化早期的步骤与骨骼肌很相似。成肌细胞在培养底物上增殖和迁移，然后成直线排列，最终融合形成多细胞核肌管。尽管用胰蛋白酶消化法可将成肌细胞传代培养3 〜 4 代，但一旦分化（融合）即不能传代培养。

2. 成肌细胞特点：易于获取，来源广泛，易于分离且体外培养增殖快，并在培养阶段易于接受外源基因。