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体外培养细胞

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细胞培养 (Cell Culture)专题:
http://ask.bbioo.com/special/experiment/Cell culture.htm

一、所谓细胞培养(Cell culture)是指细胞包括单个细胞在体外条件的生长。
组织培养的发展史已有近百年,最初的组织培养是胚胎学和微生物 学的引申,建立于无菌原则上,用天然体液(如胎汁、血浆)来维持从整体切下的组织块,对细胞进行形态和功能的观察。

通过许多学者大的改进和革新,培养基由天然动物血浆改为合成培养基,促进细胞生长物质从胎汁改为动物血清。现在全世界贮存的细胞约有万种以上。组织培养不仅是细胞生物学必需的技术,也是分子生物学、肿瘤学、遗传学和免疫学等学科必要的方法。

二.基本原理和方法
体外培养细胞的生存条件:
(一)营养。
体外培养细胞所需的营养物质与体内相同,主要有糖、氨基酸和维生素三大类。目前市面上销售的合成培养基如1640、199等所含的氨基酸已足够,但在使用合成培养基时,仍需加入一些天然成份,如人或动物的血清、血浆和胎汁等。目前主要使用血清,以牛血清为主。血清的生物效应早已证明,它含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其它活性物质等。不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁。不同血清对细胞作用不同。以小牛血清最好,成年牛和马血清次之。合成培养基中不加血清也能维持细胞生存,但不能很好生长,加入5%的血清,对大多数细胞来说,能维持细胞不死和缓慢生长,要使细胞正常生长,一般需加10~15%的小牛血清。每个批号血清使用前要加热处理,一般灭活于56℃水浴中30分钟,每个批号血清使用前要加热处理,一般灭活于56℃水浴中30分钟,每5分钟摇一次。10%血清营养液能促进细胞增殖称为生长液,2~5%血清培养液不能使细胞增殖而只能维持其生存称为维持液。添加血清,虽利于细胞生长,但增加了不明成分,给分析实验结果带来了困难。因此,人们正在探索不用血清的无血清液并已取得了一定进展。
(二)环境
1.无菌:无菌是保证培养细胞生存的首要条件。培养液不仅对细胞是高营养物,对细菌和霉菌也是高度营养物,细胞培养中如污染微生物,其繁殖比细胞快且能产生毒素使细胞死亡,因此细胞培养技术的关键之一是防止污染。污染微生物可来源于组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身。因此,培养室的空气等要彻底消毒,所有操作均要严格实行无菌操作,各种物品拿入操作台前应消毒,用洒精擦表面,用前于紫外线照;操作者洗手、泡手,酒精擦手,打开培养管前须在火焰上烙烧一下瓶口以使灰尘固定,操作时须将瓶、管斜放,吸管注入液体应避免和瓶口接触,操作时禁止讲话。
2.温度:组织培养的最适温度为35-37℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢和生长将会受到影响,甚至导致死亡。培养细胞对低温的耐受力比高温强。温度增加2-3℃对细胞产生不良影响,使之在24小时死亡,温度在43℃以上,细胞大多被杀灭,而低温对细胞影响较小,细胞置于25-35℃时,细胞仍能生存和生长,但速度缓慢,放在4℃数小时之后,再置37℃培养,细胞仍能继续生长。
3.气体:气体也是细胞生存的必需条件之一。所需的气体主要有O2和CO2。O2参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。CO2既是细胞代谢产物也是细胞所需成分。它主要与维持培养液pH值有直接关系。
4.pH值:多数细胞的适宜pH值为7.0-7.4,偏离此范围对细胞可产生有害的影响。各种细胞对pH值的要求也不完全相同,但总的来说,细胞耐酸性比耐碱性大一些。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐/ CO2。细胞代谢产生的各种酸使pH下降,而培养液中的NaHCO3产生CO2排入空间又使pH增加。
5.培养器皿的处理:培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长影响很大,除少数悬浮生长的细胞外,绝大多数细胞属于贴壁依赖性细胞或培养物。它们只有贴附于不起化学作用的物体的表面时,才能生长、生存或维持功能。目前,常用的器皿主要有玻璃及塑料二大类。玻璃器皿一般须用清洁液浸泡1至7天,清水冲洗20次后再用蒸馏水过洗2次,烤干备用。用前160℃高温消毒2小时后使用。96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡4小时后,清水洗净再用1N HCL浸泡4小时,用清水冲洗后再用蒸馏水漂洗,37℃干燥后,紫外线灯照射消毒;新橡皮塞须先用1/2NnaOH煮沸15分钟,冲洗后再用4%HCL煮沸15分钟,清水冲洗后用蒸馏水洗5次,煮沸10分钟灭菌,或送高压灭菌。
总之,细胞在适当的培养条件下可迅速增殖,但若遇到不良环境细胞会变圆,停止生长,甚至死亡,这是细胞的保护机制。综上所述,细胞培养的基本条件主要包括了营养液、无菌条件、PH、温度、气体条件和培养器皿的清洁度。

三.常用的培养方法
根据培养物细胞生物学的特点,组织培养可分为原代培养和传代培养。亦可根据培养条件和器皿的不同而分为静置培养和动态培养。静置培养为最常见的方式,细胞可为贴壁型细胞,亦可为悬浮的不贴壁细胞。

细胞培养(Cell Culture)专题:
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