体外培养细胞的染色体标本制备实验

1． 体外培养的细胞，在倒置镜下观察到有较多的分裂细胞（传代后24h，圆形发亮的细胞）时，加入秋水仙素溶液，终浓度为0.3μg/ml培养液；

2． 继续培养3h；

3． 胰酶消化收集细胞至离心管；

4． 离心1000转/min，离心10min，去上清；

5． Hanks液洗，离心，去上清；

6． 低渗处理：加入0.075mol/L KCl溶液8ml，置37℃恒温水浴中30min，用吸管稍吹打（同上）；

7． 固定及制片如外周血染色体的制备。

1． 秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长,故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。

2． 固定液应在使用前临时配制。

3． 载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。

4． 染色体分裂指数低：患者处于非常时期（放、化疗期）；培养基营养成分不良；培养基pH偏低或偏高；PHA过量或不足；小牛血清质量不高；培养箱温度偏低；秋水仙素处理时间过短。

5．接种的血样愈新鲜愈好。

6. 培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡，使凝块散开，继续放回37℃恒温箱内培养。

Carnoy固定液：

固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。

低渗液（hypotonic solution）

低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。②用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。

Giemsa染液

Giemsa原液配制：称Giemsa粉末0.5g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml）。56℃中保温90～120min。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存。使用时按要求用PBS稀释，一般稀释10倍。