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体外培养细胞和组织细胞DNA PCR反应模板的制备

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1g哺乳动物细胞,可以得到约2mg DNA。

试剂与配制

1. 磷酸缓冲液;

2. 酚/氯仿/异戊醇25:24:1;

3. 7.5mol/L醋酸铵;

4. 100%和70%乙醇;

5. TE缓冲液;

6. 消化缓冲液:100mmol/L NaCl、pH8.0 10mmol/L Tris.Cl、pH8.0 25mmol/L EDTA、0.5%SDS、0.1mg/ml蛋白酶K(临用前加入)。

操作方法

1. 标本的制备

A)组织标本的制备:①新鲜的生物组织尽可能迅速用剪刀清除筋膜等结缔组织,快速置于液氮或70℃冰箱中。如果是肝组织块,应立即清除含高降解酶的胆囊,②取200mg~1g组织,磨碎组织块,使之成为粉沫状;③每100mg组织中加入1.2ml消化缓冲液,必须无凝块或结块。

B)组织培养细胞的制备:①悬浮培养细胞直接经2500r/min离心10min,弃上清,收集细胞;贴壁细胞用胰酶消化后,1200r/min离心5min,弃上清,收集细胞;②加1~10ml预冷的PBS重悬细胞,1200r/min离心5min,弃上清;③重复步骤②,再用PBS洗一次后,加等体积的消化缓冲液。若细胞数低于3×107 ,加0.3ml消化缓冲液。若细胞数高于108 ,加1ml消化缓冲液。

2. 细胞或组织样品在50℃下轻轻振摇保温12~18h(样品呈粘性状,经12h孵育后,组织样品几乎全部溶解,无块状,并且组织培养细胞应该比较清亮)。

3. 用等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提,3000r/min离心10min,如果分离不理想,可再次加入消化缓冲液,但不加蛋白酶K,重复离心。如果在两相之间有一层致密的白色物质,需重复抽提。

4. 将上层水相移至一新的试管内,加1/2体积的7.5mol/L醋酸铵和2倍体积的无水乙醇沉淀DNA,3000r/min离心2min,回收DNA。

5. 加70%乙醇洗DNA沉淀,倾去乙醇,空气干燥DNA沉淀团。

6. 将DNA沉淀重悬于TE缓冲液中,可以在室温下轻轻振荡混匀和65℃数小时使之溶解。加用0.1%SDS溶解的1μg/ml RNA酶,37℃孵育1h,再用上述方法抽提,乙醇沉淀。

7. 4℃或者0℃贮存。

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