双缩脲法测定蛋白质含量

实验目的：
1.掌握分光光度计的使用方法。
2.掌握标准管法测物质含量的方法。
3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。
一、原理：
双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。
蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu ²⁺ 络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度 成正比，可以用比色法进行测定。双缩脲法最常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。

二、 试剂 和器材
试剂 :
(1) 标准蛋白溶液（5mg/ml）:准确称取已定氮的酪蛋白(干酪素或牛血清白蛋白)用0．05mol/L氢氧化钠溶液配制，冰箱存放备用。
(2) 双缩脲试剂:溶解1.5g硫酸铜（CuSO ₄ ·5H ₂ O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC ₄ H ₄ O ₆ ·4H ₂ O）于500ml蒸馏水中，在搅拌下加入300ml10％氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存。
(3) 样品血清:动物血清用水稀释10倍，置于冰箱保存备用。标准曲线法所用的血清需20倍稀释。
器材:分析天平、分光光度计、 恒温水浴箱、 试管 、 吸量管等

三、操作方法：
1.取三支 试管 按下表操作

试管号	空白管	标准管	测定管
血清（mL）	0	0	1.0
标准蛋白（mL）	0	1.0	0
蒸馏水（mL）	2.0	1.0	1.0
双缩脲试剂（mL）	4.0	4.0	4.0

2、摇匀，37℃ 水浴 20min后用 分光光度计 于540nm波长处比色，以空白管调零点，测得各管吸光度。

3、计算：
血清 总蛋白 质(g／100ml）＝A _测 /A _标 ×0.005×100/0.1