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双缩脲法测定蛋白质含量

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实验目的:
1.掌握分光光度计的使用方法。
2.掌握标准管法测物质含量的方法。
3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。
一、原理:
双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物,在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物,此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。
蛋白质含有多个肽键,在碱性溶液中能与Cu 2+ 络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度 成正比,可以用比色法进行测定。双缩脲法最常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。

二、 试剂 和器材
试剂 :
(1) 标准蛋白溶液(5mg/ml):准确称取已定氮的酪蛋白(干酪素或牛血清白蛋白)用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制,冰箱存放备用。
(2) 双缩脲试剂:溶解1.5g硫酸铜(CuSO 4 ·5H 2 O)和6.0g酒石酸钾钠(NaKC 4 H 4 O 6 ·4H 2 O)于500ml蒸馏水中,在搅拌下加入300ml10%氢氧化钠溶液,用水稀释到1000ml,贮存于内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存。
(3) 样品血清:动物血清用水稀释10倍,置于冰箱保存备用。标准曲线法所用的血清需20倍稀释。
器材:分析天平、分光光度计、 恒温水浴箱、 试管 、 吸量管等

三、操作方法:
1.取三支 试管 按下表操作

试管号 空白管 标准管 测定管
血清(mL) 0 0 1.0
标准蛋白(mL) 0 1.0 0
蒸馏水(mL) 2.0 1.0 1.0
双缩脲试剂(mL) 4.0 4.0 4.0

2、摇匀,37℃ 水浴 20min后用 分光光度计 于540nm波长处比色,以空白管调零点,测得各管吸光度。

3、计算:
血清 总蛋白 质(g/100ml)=A /A ×0.005×100/0.1

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