自然界中的蛋白质含量测定

1双缩脲法

2紫外分光光度法（280nm波长）

3考马斯亮蓝法

4凯氏定氮法

几种方法都可以测蛋白质含量，也各有优劣，试用环境

蛋白质化学呈色反应测定蛋白质总含量是在蛋白质的各种化学呈色反应基础上建立的各种比色法（colori-metry）。目前，基于蛋白质化学呈色反应测定蛋白质总含量的方法主要有三种：如 Lowry 法、二喹啉甲酸法和考马斯亮蓝法。

原理

Lowry 法测定蛋白质总含量的基本原理涉及两步反应，第一步反应是基于原双缩脲测定法，即在碱性溶液中蛋白质中的肽键与 Cu2+反应形成紫色的络合物（两个以上肽键接近存在的情况下，在强碱性一侧与 Cu2+ 形成络合盐），其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比；第二步反应是基于酚试剂（磷钼酸和磷钨酸混合液）被蛋白质中的芳香族氨基酸（色氨酸和酪氨酸）残基还原，反应呈现深蓝色。

二喹啉甲酸法测定蛋白质总含量的基本原理是在碱性溶液中，蛋白质中的肽键能与 Cu2+ 反应生成 Cu+，BCA 试剂能与 Cu+ 反应形成稳定的紫色复合物，并在 562 nm有很强的吸收峰。

考马斯亮蓝法测定蛋白质总含量的基本原理是考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue）G-250 在 一定浓度的乙醇和酸性溶液中呈红色。在此溶液条件下，考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合，并导致考马斯亮蓝G-250的颜色从红色变为蓝色，最大光吸收峰从 465nm 移至 595nm。考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质的复合物在 595nm 波长处具有很高的光吸收系数，并与溶液中的蛋白质浓度呈正比。

通常有三种方法：

（1）茚三酮反应(ninhydrin reaction)蛋白质水解后产生的氨基酸可发生茚三酮反应。除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，所有的α氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。α氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热，反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮，再与水合茚三酮反应生成紫红色，最终为蓝色物质。脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质。该反应可广泛用于各种氨基酸的定性或定量测定。（2）双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。该反应是肽键常用的反应，即在碱性铜溶液中，肽键与铜离子形成络合物，呈紫色(在540nm有最大光吸收峰)。（3）考马斯亮蓝法：即蛋白质与一种蛋白质染料考马斯亮蓝G250反应形成复合物，该复合物在595nm有最大光吸收峰。注意：蛋白质遇硝酸也显色为黄色，不过这样蛋白质就变性了。

蛋白质化学呈色反应是一种测定蛋白质总含量的常用方法。它利用蛋白质中含有的氨基酸，特别是色氨酸和苯丙氨酸，发生特定的化学反应，从而使蛋白质呈特定的颜色。常用的蛋白质化学呈色反应有丹比尔呈色法和酶联免疫吸附法。

丹比尔呈色法（Bradford assay）是一种常用的蛋白质化学呈色反应，其原理是利用蛋白质中的苯丙氨酸和色氨酸与丹比尔试剂（Coomassie Brilliant Blue G-250）发生反应，使蛋白质呈蓝色。实验流程如下：

准备样品：将蛋白质样品（如细胞提取物、培养基中的蛋白质等）加入容量为1 mL的测定管中。

加入丹比尔试剂：向测定管中加入约200 μL的丹比尔试剂。

振荡混匀：用振荡器将测定管中的溶液混匀。

加入标准品：向测定管中加入蛋白质标准品，一般使用bovine serum albumin（BSA）作为标准品。

光度测定：将测定管中的溶液在595 nm处进行光度测定。根据标准曲线，可以计算出样品中蛋白。