受体的放射配体结合分析技术
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受体的放射配体结合分析技术
受体是存在于细胞表面、胞浆或细胞核内的生物活性物质，其功能是和细胞外的信息分子（配体）特异性结合，将信息转变为生物效应。受体现已可从细胞或组织中分离、提取，进行定量和定位分析。放射受体分析（radioreceptor assay，RRA）或受体的放射配体结合分析（radioligand binding assay，RBA）是建立在放射性标记配体与受体之间的结合反应，它是目前对受体分子进行定量和定位分析研究的灵敏、可靠的一项技术。在药物设计、作用机理、生物效应及疾病的病因探讨、诊断和治疗等方面的应用已有较大发展。
【基本原理】
放射受体分析的原理与免疫放射测定相似。应用放射性核素标记配体，在一定条件下与相应的受体结合成配体-受体复合物。放射受体分析可用于测定受体的亲和常数、解离常数、受体结合数以及定位分析。
以下以人外周血白细胞糖皮质激素受体放射配体结合分析作为实例进行介绍。
【试剂及材料】
（1）〔1，2，43 H〕-地塞米松（3 H-Dex）：试验时稀释成10mci/ml。
（2）3%葡聚糖（dextran T 500）溶液
（3）红细胞溶解缓冲液：0.155mol/L NH4 Cl，10mmol/LKH2 PO4 ， 10mmol/LK2 HPO4 ，1mmol/L EDTA ，pH7.2。
（4）均相闪烁液：PPO 7.0g，POPOP 0.4g，萘75g乙二醇甲醚350ml，二甲苯加至1000ml。或PPO 3.0g，POPOP 0.4g，萘110g，二氧六环1000ml。
（5）pH7.2 Hanks液和pH7.2，10mmol/L PBS
【操作方法】
（1）分离白细胞：取静脉血7-8ml，肝素抗凝。用3%葡聚糖 T 500溶液促进红细胞凝聚沉降，吸取富含白细胞的血浆层。离心后，再用溶红细胞缓冲液将残存的红细胞溶解去除。白细胞存活率应大于95%，红细胞残存率应小于0.01%。用Hanks液配制成5´106 个/ml；
（2）如欲去除内源性皮质醇，可将白细胞悬液预先于35℃放置15min，待内源性皮质醇-受体复合物解离。用Hanks液洗涤后再将白细胞重悬浮；
（3）取1ml 5´106 个/ml白细胞悬液，加一定浓度3 H-Dex。作Scatchard标图法时，于2-20nmol/L3 H-Dex之间作6-7个浓度；作一点结合分析时，用接近饱和度的3 H-Dex 10nmol/L；
（4）21℃保温3h，加3ml冷的pH7.2，10mmol/L PBS终止反应。于4℃，3000r/min离心5min，吸弃上清液；
（5）用漩涡振荡器将细胞沉淀团混匀，用冷的pH7.2，10mmol/L PBS洗涤两次，去除游离的甾体；
（6）于细胞沉淀物内加98%甲酸0.1ml，置60-70℃作用30-60min，将细胞消化。加入8ml均相闪烁液，用闪烁计数器计数cpm值；
（7）用外道比法校正，所得cpm为总结合值。
（8）用加相同浓度3 H-Dex和加2000倍醋酸地塞米松的平行管的cpm为非特异性结合值。总结合cpm减去非特异性cpm即为特异性cpm。结果以特异性结合fmol/细胞数或位点/细胞表示。
