放射免疫分析技术(用核素标记的抗原检测抗原)
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放射免疫分析技术(用核素标记的抗原检测抗原)
【基本原理】
放射免疫分析技术(radioimmunoassay,RIA)一般采用竞争结合分析技术。其基本原理为放射性标记抗原和被测抗原(或标准品)对有限的特异性抗体发生可逆性的竞争结合反应,最终形成的放射性抗原-抗体复合物量与被测物的含量呈负相关。当抗体的量固定不变时,免疫复合物的形成就受到待测抗原含量的制约。如反应系统中待测Ag含量高时,对Ab的竞争结合能力就强,Ag-Ab复合物的形成量就会增加,Aundefined-Ab复合物则相对减少;反之,当待测Ag含量低时,对Ab的竞争结合能力弱,Aundefined-Ab复合物的形成量即增多。
【基本试剂及材料】
(1)标准品:是竞争放射免疫分析的定量依据,标准品应尽量与待测抗原的化学结构完全相同。在某些特殊情况下,也可用结构相似,与抗体亲和力相近的物质代替,但必须列出其换算系数。
(2)多克隆或单克隆抗体
(3)放射性标记物
(4)分离剂:用于将结合和游离的部分分离。
(5)γ计数仪
【操作方法】
以测定血清中胰岛素含量作为实例
(1)按下表逐一加样(加样量为ml,均设双复管)
标准管(mU/ml) 检测管
0 10 20 40 80 160
标准品(不同浓度)100 100 100 100 100 100
待测血清 100
抗血清(一抗) 100 100 100 100 100 100 100
分析试剂 100 100 100 100 100 100 100
混匀,第一次温育,37℃温育60min
核素标记的胰岛素 100 100 100 100 100 100 100
混匀,第一次温育,37℃温育60min
第二抗体 100 100 100 100 100 100 100
混匀,第一次温育,37℃温育60min
分析试剂为0.05mol/L, pH7.4 PBS, 内加1%-2%
(2)正常兔血清离心洗涤后,用γ计数仪分别测量各管沉淀物的放射性强度,以两管cpm的均值表示;
(3)以0mU/ml标准管的cpm为B0,分别计算结合率(B%,即B/B0 ´100%);
(4)用B%为纵坐标,不同浓度的胰岛素标准品为横坐标绘制标准曲线,然后根据检测管的B%,从标准曲线中即可查得相应的胰岛素含量。
【注意事项】
在RIA反应中,标记抗原与抗体结合后,必须分离结合抗原和游离的放射性标记物,然后分别对游历部分和结合部分的放射性进行测定。因此选择合适的分离剂和方法十分重要,要求分离效率高,重复性好,非特异性结合率低,来源方便和经济实用。在上述胰岛素测定液相分离技术中,是以第二抗体作为分离剂(双抗体法)。第二抗体法的优点是特异、稳定、非特异性结合低;其缺点是抗体用量大,费用高和受血清蛋白浓度的干扰。除第二抗体法外,还有用饱和硫酸铵或硫酸钠作为分离剂的盐析共沉淀法;以活性炭末、硅胶微粒等吸附游离抗原的吸附法;以及利用聚乙二醇(PEG 6000)、二氧六烷等作为沉淀剂。使用此类分离剂虽然方法简便,价廉易得,但均为非特异性分离技术,易受环境温度、pH值、试剂浓度等因素的影响,非特异性结合率较高。近年来,研究较多和分离效果较好的是固相分离技术,即将特异性抗体或第二抗体,以物理吸附或共价键结合法与聚苯乙烯试管、塑料小珠、琼脂糖珠和磁性微球等固相载体连接,制成特异性固相吸附剂。此类方法稳定性好,使用方便,不受一般非特异性因素影响。