免疫放射分析技术（用核素标记的抗体检测抗原）

互联网2010-12-02

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免疫放射分析技术（用核素标记的抗体检测抗原）

1968年Miles和Hales建立了利用核素标记的抗体检测抗原的放射分析法，为了与放射免疫分析区别，故称免疫放射分析技术（immunoradiometric assay，IRMA）。由于它应用核素标记抗体作为示踪剂，在反应体系中加入过量的抗体，待测抗原（或标准品）与和核素标记抗体进行全量反应，故亦称非竞争性免疫分析法。IRMA与RIA相比较有以下特点：①IRMA反应系统中应用的标记物为免疫球蛋白。易于提纯和进行碘化标记，标记抗体的比活度较高，有利于提高分析的灵敏度，且不同抗体的标记方法基本相同；而在RIA中应用的标记物是抗原。抗原种类繁多，化学结构各异，较难获得纯品，标记方法亦多种多样；②在IRMA反应系统中使用过量的标记抗体，直接与抗原结合，不存在竞争结合的复杂反应，因此反应速度较快，即使使用亲和力较低的单可隆抗体，也能满足实验要求；而在RIA中抗体是微量的，所以一定要用高亲和力的多可隆抗体；③IRMA使用的标记抗体和固相抗原在反应中都是过量的，只有待测样品加样误差才会影响分析结果，因此IRMA的批内和批间变异（CV%）比较小；而RIA使用的抗体和标记抗原在反应中是固定量的，加样误差可严重影响测定结果。

【基本原理】

将核素标记在抗体上，然后以过量的标记抗体与待测抗原结合，未结合的标记抗体通过和固相的抗原免疫吸附剂结合而去除，溶液中的放射性与待测抗原的含量呈正相关。根据检测过程的操作步骤不同，有以下几种类型：

直接IRMA法：将待测抗原与过量的标记抗体进行温育，使二者结合，然后加入固相抗原免疫吸附剂再次温育，吸附游离的标记抗体。离心去除沉淀物，测定上清液中放射性强度，根据标准曲线即可得知待测样品中抗原的含量。

双抗体夹心IRMA法：在待测抗原内依次加入固相抗体和标记抗体，反应后形成固相抗体（Ab1）-抗原-标记抗体（Ab2）复合物，洗涤去除游离的标记抗体，测定固相抗体或载体上免疫复合物的放射性强度，，根据标准曲线即可得知待测样品中抗原的含量。此法仅用于检测有多个决定簇的多肽和蛋白质抗原。

间接IRMA法：此法是在上述双抗体夹心法的基础上，进一步改良为用核素标记抗Ab2的抗体（羊抗兔或抗鼠的IgG），反应后形成固相抗体（Ab1）-抗原-Ab2~undefinedAb3（标记抗抗体）的四重免疫复合物。其中，Ab3可作为通用试剂，可省去标记针对不同抗原的特异性抗体。

BSA-IRMA法：是将生物素-亲合素系统（BSA）引入免疫放射分析，建立的新一代IRMA。此法最大的优点是使用生物素化抗体和以核素标记亲合素为示踪剂，可以通用于甾体类、前列腺素等小分子物质的检测。由于1个抗体分子上可标记数十个生物素分子，而每个亲合素又可与4个生物素分子结合，从而产生多级放大效应。同时生物素与亲合素之间的亲和力要比抗原抗体间的亲和力大10万-100万倍，二者结合极为稳定，因此，使其灵敏度、特异性和精密度都大大提高。目前一些超灵敏度的IRMA分析试剂盒就是应用上述原理制成的。

【基本试剂及材料】

（1）标记抗体（2）固定抗原吸附剂（3）标准抗原（4）待测样本（5）γ计数仪和低温离心机

【操作方法】以固相双抗体法测定血清中促甲状腺素（TSH）为实例

（1）按下表逐一加样（加样量为ml，均设双复管）

标准管（mU/ml） undefined 检测管

0 0.15 0.5 1.5 4 15 60 150

TSH标准品 200 200 200 200 200 200 200 200

待测血清 200

¹²⁵ I-TSH抗体 100 100 100 100 100 100 100 100

混匀，37℃温育120min

弃上清(undefined除外，以下同)，加2ml洗涤液，放置2min

弃上清，再加2ml洗涤液，放置2min

弃上清，将各管倒置在吸水纸上

（2）用γ计数仪分别测量各管放射性强度，以两管cpm的均值表示，分别计算结合率（B%，即B/undefined ´100%）；；

（3）用B%为纵坐标，不同浓度的TSH标准品为横坐标绘制标准曲线，然后根据检测管的B%，从标准曲线中即可查得相应的TSH含量。