免疫放射测定

免疫放射分析（immunoradiometric assay , IRMA）的基本原理是用放射性同位素标记抗体，测定相应抗原，标记抗体与抗原结合产物的放射强度与抗原浓度成正比，因而灵敏度较 RIA 法更高。RIA 与 IRMA 相比通常存在以下不足：由于是竞争性结合，不能达到全部待测物与抗体结合；为了达到适宜的灵敏度，测定系统中标记抗原与抗体的结合 必须有一个较高的起点（基准）；放射性同位素标记可能引起小分子抗原免疫反应性的改 变，因而标记物与标准或待测抗原同抗体的反应方式可能不完全相同；游离 Aundefined 与 Ag-Ab 的分离方法复杂、费事，不易大样本测定。而 IRMA 基本弥补了 RIA 的上述缺点，其反应式为：

随着单克隆技术的发展，IRMA 检测普遍采用了单克隆抗体，具有较高的特异性，并利用固相支持物，建立起固相 IRMA 检测方法。

免疫放射分析的基本原理是用放射性同位素标记抗体，测定相应抗原，标记抗体与抗原结合产物的放射强度与抗原浓度成正比，因而灵敏度较 RIA 法更高。

固相 IRMA 检测方法的基本原理是：将单克隆抗体与乳胶颗粒或聚苯乙烯塑料试管偶联，然后加入抗原。由于单克隆抗体稍许过量，因此，可与抗原完全结合，并决定了反应的特异性；在反应结合完成后，将未结合抗原洗去，再加入 ¹²⁵I 标记的抗原特异抗体（Abundefined），与结合在单抗上的抗原反应，形成单抗-抗原-Abundefined 复合物，在反应结束后，洗去未结合的 Abundefined，测定结合于固相支持物上的单抗-抗原-Abundefined 复合物的放射性强度。因此，该方法分离 Ag-Aundefined 复合物与游离 Aundefined 的方法比较简单，而且放射强度与抗原量成正比（如图），适合大样本快速测定。

试剂：

重组人卵泡抑素（follistatin，FST），Na125I，Iodogen，抗 FST 单克隆抗体，兔抗 FST 多克隆抗体，羊抗兔 IgG 抗体，0.04 mol/L pH7.4 PBS，0.05 mol/L pH9.5 碳酸盐缓冲液。

仪器：

Sephadex G25 凝胶层析柱，星形免疫试管。

以人卵泡抑素免疫放射分析为例，其基本过程如下：

FST IRMA 检测程序：取星形免疫试管，每管包被 0.2 ml 单克隆抗体（2.5 μg/ml），包被液为 0.05 mol/L pH9.6 的碳酸盐缓冲液，4 ℃ 过夜，以 0.02 mol/L pH7.4 PBS 内含 0.05% Tween20 洗 3 次，加入 0.04 mol/L pH7.4 PBS 稀释的 2% BSA 阻断非特异吸附，室温反应 1.5 小时，洗 3 次，加入 0.04 mol/L pH7.4 PBS 稀释的标准 FST 100 μl，再加入 100 μl 兔抗 FST 多克隆抗体（以 0.04 mol/L pH7.4 PBS 内含 0.1% Tween20、0.04% NaN3、0.4% BSA 溶液，1:500 稀释），室温反应 2 小时，洗 3 次，加入 200 μl ¹²⁵I 标记羊抗兔 IgG（100000 cpm），室温反应 2 小时，洗 3 次，在 γ 计数仪上测定反应管的放射计数率强度，绘制标准曲线，可在标准曲线上查出样品中的 FST 含量。

（1）氯胺 T 标记过程，必须保证 pH 值的稳定，因此，常用 0.05～0.5 mol/L pH7.5 PB 缓冲液维持 pH 值的相对稳定。

（2）氯胺 T 标记过程包含了一个强的氧化和还原，可致某些多肽和蛋白质失活。因此，反应时间应控制在适度的范围内，一般以 30～60 秒氧化时间为宜。氯胺 T 标记法多用于小分子蛋白（多肽）标记，标记率较高。

（3）Iodogen 法中，如果没有 N₂ 气，也可采用 CO₂ 温和地吹干，其效果类似。

（4）Iodogen 法在标记大分子蛋白质方面比氯胺-T 法稳定，蛋白质活性保持较好，尤其是在 ¹²⁵I 标记 Ig 时更具有优越性，¹²⁵I 利用率通常在 60% 以上，蛋白质标记可达 15000 cpm/ng 蛋白。

（5）根据抗原的不同，免疫复合物分离的二抗法，一般可根据情况加入 4% 左右的 PEG，促进 Ag-Ab 免疫复合物的沉淀形成。

（6）固相 IRMA 采用单克隆抗体包被时，高 pH 值缓冲液有时会损伤抗体的生物学活性，因此，包被液也经常采用 pH7.5 磷酸盐缓冲液或 pH8.0 硼酸盐缓冲液替代 pH9.5 碳酸盐缓冲液。