黄体生成素的放射受体测定

[实验目的]
以放射受体分析法（Radio-Receptor-Assay,RRA）测定动物血浆LH含量为例，学习和掌握放射受体分析法基本原理及方法。
[实验原理]
放射受体分析法(RRA)是竞争性放射分析法之一。放射性标记激素和受体发生可逆的结合而形成复合物，此时，如果体系中加入未标记激素，就会同标记激素竞争受体上的结合位点。当放射性标记激素、受体的含量恒定时，随着未标记量增多，放射性标记激素一受体结合率将递减。这样就可以绘出激素受体结合率-剂量标准曲线。根据被测样品激素-受体结合百分率,在标准曲线上可查到被测样品中该激素的含量（见实验13.5）。
由于绒毛膜促性腺激素(hCG)能与大鼠卵巢黄体细胞上的LH受体结合，而许多动物的黄体生成素(LH)又能与hCG对大鼠卵巢黄体细胞上的LH受体产生竞争性结合。当以不同浓度的放射配体（※hCG）和定量的LH受体制品孵育达到平衡时，用一有效快速方法使※hCG-LH受体分离出来，可测定※hCG-LH受体结合放射量，即为相应浓度下的总结合量。当大剂量的非放射hCG与LH受体一起孵育时，以占据LH受体的识别位点，不让※hCG与LH受体结合，在该情况下测得的结合量称为非特异性结合量。总结合量与非特异性结合量之差即是相应浓度下的特异结合量。根据实验13.5原理可计算不同浓度的标准hCG与LH受体的结合百分率。同样也能计算出不同样品中LH与LH受体的结合百分率，从而推算出样品中的LH浓度。
[实验对象]
25~30日龄雌大白鼠。
[实验药品]
被检动物血清(血浆)， 125I-hCG，缓冲液，生理盐水，牛血清白蛋白(BSA)，hCG，孕马血清促性腺激素(LCG，PMSG)。
试剂配制：
1.0.04 mol·L ^-1 pH7.4 Tris-HCl缓冲液（含1％BSA）。
(1)取三羟甲基氨基甲烷2.438 g加重蒸馏水至100 ml，即为0.2 mol·L ^-1 Tris液。
(2)取0.2 mol·L ^-1 Tris液25 ml加0.1 mol· L ^-1 HCl 42 m1，即配成0.2 mol·L ^-1 Tris-HCl(pH7.4)。
(3)用5倍重蒸馏水稀释0.2 mol·L ^-1 Tris-HCl液，并调整pH到7.4即成0.04 mol·L ^-1 Tris-HCl缓冲液，再加BSA(使含1％)。
2. 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液(PBS)pH 7.4
NaH ₂ PO ₄ (H ₂ O) 34.5g Na ₂ HPO ₄ 35.5g
NaCl 4.5g BSA 2.5g
重蒸水 加至1000 mI
[ 仪器 与器材]
注射器(2ml)，外科剪，外科镊，玻璃匀浆器(10 ml)，尼龙网，可调微量加样器及吸头(50 ?l，100 ?l，1000 ?l)，酸度计，离心机，恒温水浴，试管振荡器，水泵，γ-计数仪。
[实验方法和步骤]
1.受体的制备
(1)选用25~30日龄雌性大白鼠5只，每只皮下注射PMSG 50 IU，48 h后再注射hCG 25 IU，6~10天(卵巢受体含量最高)用颈椎脱臼法处死，摘取黄体化的卵巢(卵巢增大，可见卵巢上陈旧的排卵点)。
(2)大鼠卵巢匀浆制备：将黄体化的卵巢置于4 ℃Tris-HCl缓冲液中剥离脂肪、去膜和血管后称重，每100 mg卵巢(湿重)加10 m1缓冲液，在玻璃匀浆器勾浆6次左右(每次以20 r·min-1 匀浆约1 min，关键看是否已匀浆出物质)，然后用双层尼龙网过滤，除去残余结缔组织，滤液以800 r·min-1离心10 min弃去沉淀物，留上清液再用2000 r·min-1离心20 min，弃去上清液，沉淀按每ml缓冲液含100 mg卵巢组织的浓度制成悬浊液，分装成小瓶于-20 ℃保存备用。
(3)受体稀释曲线（以选择最适受体浓度）： 分别取卵巢组织匀浆0.2，0.5，1，2，3，4，6，8 mg加125I-hCG 100?l，加磷酸缓冲液，最终反应容积500 ?l，测定结合率，应选获得较大结合率的最小受体量（如2 mg ）作为测定中的受体用量。