H33342释放法检测单核-巨噬细胞胞毒作用
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H33342 释放法检测单核-巨噬细胞胞毒作用
【基本原理】
H33342(Hoechst33342)为DNA的特异性荧光染料,可用其标记肿瘤细胞以检测单核细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。被损伤的靶细胞DNA断裂后,H33342释放到上清液中,采用微量荧光仪可定量测定上清液中的荧光强度。效应细胞的杀伤活性与靶细胞释放的荧光强度呈正相关。该方法同样可用于CTL、NK、LAK或TIL等杀伤细胞的活性检测。
【试剂及材料】
(1) 靶细胞(L929细胞株,对单核细胞的杀伤活性敏感)
(2) H33342
(3) 微量荧光"W"测量板(德国Dynatech公司产品)
(4) 用自动微量荧光分析仪(Micro-FluoDynatech)
【操作方法】
(1) 从单个核细胞中采用粘附法分离的单核细胞,经非特异性酯酶(ANAE)和台盼蓝染色,细胞纯度应>90%,细胞活力应>95%;
(2) 收获靶细胞并将细胞浓度调至1×107 /ml;
(3) 加入终浓度为10μmol/L的H33342,置37℃标记2h;
(4) 用DMEM液离心洗涤3次,重悬浮于完全DMEM培养液中;
(5) 将效应细胞和标记的靶细胞按一定比例(一般为20-50∶1)加入96孔圆底培养板200μl/孔,作3个复孔;置37℃5%CO2 温箱培养20h;
(6) 离心后从每孔取150μl上清液,分别加至微量荧光"W"测量板;
(7) 用自动微量荧光分析仪(Micro-FluoDynatech)测定3孔的OD值,求得平均值。激发波长为360nm,发射波长450nm。每次试验同时作下列对照:自发释放值:测定单独培养的靶细胞上清液荧光强度。最大释放值:测定靶细胞用1%Triton X-100裂解后的荧光强度。
【结果分析】
实验组OD值-自然释放组OD值
单核细胞杀伤活性(%)= ─────────────── ×100%
最大释放组OD值-自然释放组OD值