人血性单核巨噬细胞Ficoll密度梯度离心法分离

最新修订时间：2022-02-10

简介

巨噬细胞（macrophages，MΦ）是由血液中单核细胞迁入组织后分化形成的成熟类细胞，广泛分布于脾脏、肝脏、腹腔、神经系统以及结缔组织等，具有吞噬杀伤、抗原提呈及免疫调节作用。近年的研究发现巨噬细胞在不同微环境中可以发生不同性质的活化，成为具有不同表面分子和功能特征的亚群。根据其不同的表型特点和功能特点及对 Th1/Th2 应答的诱导，通常将其分为两种类型：经典活化的巨噬细胞（classically activated macrophage，CAM），又称 M1 型巨噬细胞；替代性活化的巨噬细胞（alternatively activated macrophage，AAM），又称 M2 型巨噬细胞。M1 型巨噬细胞具有杀灭微生物、参与炎症及抗肿瘤作用。M2 型巨噬细胞具有很强的免疫调节、组织修复及抗炎能力。

原理

人血性单核巨噬细胞 Ficoll 密度梯度离心法分离的基本原理是分层液聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）比重为 1.077±0.001。Ficoll 的密度为 1.2 g/ml，未超出正常生理性渗透压，亦不穿过生物膜，因而不影响单个核细胞的形态及功能。红细胞、粒细胞比重大（1.092），离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重（1.070），离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，即为外周血单个核细胞。依据单核巨噬细胞能够贴壁的特性，进一步将贴壁的单核巨噬细胞与未贴壁的淋巴细胞分开。单核细胞体外培养时可加入一定量的 rhGM-CSF，进而促进单核细胞转化为巨噬细胞。

材料与仪器

样品：

人抗凝外周血

试剂：

淋巴细胞分离液、含 10% 小牛血清的 RPMI 1640（青霉素 20000 IU/ml 链霉素 200000 IU/ml）、rhGM-CSF、3% 乙酸、PBS、anti-CD14、anti-CD68 或 anti-F4/80 标记的抗体。

仪器：

离心管、移液器及吸头、EP 管、离心机、光学显微镜、细胞计数板、橡皮棒、盖玻片、酒精棉、CO2 孵箱、超净工作台、6 孔板、流式细胞仪或磁珠分选仪。

步骤

人血性单核巨噬细胞的诱导及分离的基本过程可分为以下几步：

（1）首先于离心管中加入 5 ml 淋巴细胞分层液，然后轻轻加入经肝素处理的抗凝的人静脉血 5 ml，水平离心（2000 r/min 15 分钟）。

（2）离心后，用毛细管收取上、中层界面处的一白色云雾层狭窄带（即单个核细胞层）到另一离心管中。加入 5 倍以上体积的 PBS，充分混匀后离心（1500 r/min，15 分钟），弃上清。重复两次，弃上清。

（3）轻弹管底将细胞散开，然后加入 2 ml 含 10% 小牛血清的 RPMI1640 培养基，重悬细胞。

（4）细胞计数，调整细胞浓度为 5 x 10⁶/ml，加到 6 孔板中，2 ml/孔，置于 37 ℃、5% 的 CO2 孵箱中培养 2～4 小时后，用 PBS 轻轻洗涤 3 遍，洗去未黏附细胞。

（5）每孔加入含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基 2 ml 及 rhGM-CSF（终浓度 1000 IU/ml），置于 37 ℃，5% CO2 孵箱中培养 3～5 天，隔 2 天半量换液。

（6）用 PBS 冲洗培养板，重复 3 次，以弃去悬浮细胞。然后，加入适量培养液，用橡皮棒轻轻刮取收集，获得贴壁的巨噬细胞，计数。

（7）进一步纯化，可采用表面标志物 CD14 或 F4/80 标记，具体步骤同流式细胞术分离及免疫磁珠法。

注意事项

（1）向淋巴细胞分离液中加入人外周血时应动作轻缓，勿打破分界面，否则影响分离效果。

（2）在吸取单核细胞层时，应尽量轻柔将其全部吸出，以减少其他层细胞的混入。

（3）换液时要严格注意无菌操作。

来源：丁香实验