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MTT比色法检测TNF的生物活性

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1353
MTT 比色法检测TNF的生物活性
【操作步骤】
(1)取对数生长期的L929细胞,用0.25%胰蛋白酶消化2-3min,然后洗涤细胞2次,以去除消化液及原生长培养液;
(2)用RPMI-1640培养液调L929细胞浓度为2×105/ml;
(3)将上述细胞悬液加至96孔培养板,100 ul/孔;
(4)置37℃,5% CO2培养箱中培养24h;
(5)吸去细胞培养上清液后,各孔分别加入倍比稀释的标准品和待测样品,100ul/孔,各设双复孔,并设培养液阴性对照及空白对照(即L929细胞、标准品及待测样品均不加入,仅加培养液);
(6)同时向各孔均加入10ul放线菌素D(0.5~1μg/孔);
(7)置37℃,5% CO2培养箱中培养12-14h;
(1) 直接于每孔中加入MTT溶液,10μl/孔 ,37℃孵育4h;
(2) 从每孔中轻轻吸出培养上清液100μl/孔 ,弃去 ,再于每孔中加入酸化异丙醇或DMSO,100μl/孔,混匀,置室温10min;
(3) 用酶标仪以检测波长570nm,参考波长630nm分别测各孔OD值。
【结果分析】
(1) 取双复孔平均值,各孔OD值为OD570 nm-OD630 nm,再减去空白对照OD值。
(2) 根据各孔OD值,分别计算出各稀释度的标准品和待测样品对应的L929细胞死亡率。可按下式计算:
各孔细胞死亡率
=
阴性对照孔OD-含TNF孔OD
×
100%
阴性对照孔OD
(3)以Log2 [稀释度]为横座标(X),以细胞死亡率(%)为纵座标(Y),分别绘制标准曲线和待测样品曲线,根据导致50%细胞死亡的标准品和待测样品曲线,根据导致50%细胞死亡的标准品和待测样品稀释度,按下式计算样本TNF的活性单位:
TNF的活性单位
(U/ml)
=
标准品导致50%细胞死亡的待测样品稀释度
×
标准品活性单位
(U/ml)
导致50%细胞死亡的标准品稀释度
(4)亦可根据正态概率纸法和概率单位法求得待测样品TNF活性单位,可参见IL-1、IL-2的生物活性检测部分及医学统计学的有关内容。
【注意事项】
(1) L929细胞要充分洗涤,以去除原培养液,同时应均匀分布于各孔中,以免影响检测结果。
(2) L929细胞不宜生长过密,只要孔内长成单层即可使用。
(3) L929细胞存活率应>95%。
(4) L929细胞随着传代或受其他因素影响,对放线菌素D的敏感性会有差异,应先作预试验确定其使用浓度。
(5) 倍比稀释TNF标准品和待测样品时,应以1:2开始至少6个稀释度。
(6) MTT染色,其着色深浅不但与细胞数有关,还与细胞激活有关。如某种因素激活细胞后,其代谢率将增强,线粒体琥珀酸脱氢酶活性亦增强,着色也将加深。因此MTT染色时,应考虑待测样品中是否含有能激活靶细胞的因素存在。
(7) 加入酸化异丙醇后,应在1h内测定各孔OD值。
(8) 本法亦可适用于待测细胞mTNF的检测。

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