结晶紫法检测TNF的生物活性

TNF包括TNFα与TNFß两型，它们具有极其相似的生物学活性，在体内外可对一些肿瘤细胞或细胞系起杀伤作用，而对正常细胞则无细胞毒效应。

根据这一特点，可利用TNF对敏感靶细胞的细胞毒效应，在体外检测TNF的活性水平，既可检测分泌型TNF（sTNF），也可检测膜结合型TNF（mTNF）。最常用的方法是体外检测TNF对小鼠成纤维瘤细胞（L929细胞）的细胞毒效应。

一、基本原理

TNF对L929细胞有细胞毒作用，如同时加用转录抑制剂放线菌素D，则可提高L929细胞对TNF的敏感性10～100倍。利用染料结晶紫或MTT可使活细胞染色，再用脱色液将染料脱出，测定其OD值，即可反应细胞的存活状态或TNF对L929细胞的杀伤率，通过计算细胞死亡率，并与sTNF标准品对照，即可检测待测样品sTNF活性单位。

二、材料和试剂

1. L929细胞株（存活率应＞95%）

2. TNF标准品：作倍比稀释（100 U/ml～0.1 U/ml）。

3. 待测样品：作倍比稀释至少6个不同稀释度。

4. 0.25%胰蛋白酶

5. RPMI-1640培养液及PBS

6. 0.25%结晶紫（溶于20%甲醇中），或者5mg/ml MTT（溶于PBS中）

7. 放线菌素D（分存液浓度为100 ug/ml）

8. 柠檬酸钠缓冲液（0.9%柠檬酸钠，0.02mol/L盐酸，47.5%乙醇，为脱色液）；酸化异丙醇（0.04mol/L HCL异丙醇）

9. 96孔细胞培养板，刻度吸管，毛细吸管，加样器（头），刻度离心管，离心机，细胞计数板，倒置显微镜，超净工作台，CO2 培养箱。

10.酶标测定仪，570nm滤光片，630nm滤光片。

三、操作步骤

1. 取对数生长期的L929细胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗涤细胞2次，以去除消化液及原生长培养液；

2. 用RPMI-1640培养液调L929细胞浓度为2×105 /ml；

3. 将上述细胞悬液加至96孔培养板，100 ul/孔；

4. 置37℃，5% CO2 培养箱中培养24h；

5. 吸去细胞培养上清液后，各孔分别加入倍比稀释的标准品和待测样品，100ul/孔，各设双复孔，并设培养液阴性对照及空白对照（即L929细胞、标准品及待测样品均不加入，仅加培养液）；

6. 同时向各孔均加入10ul放线菌素D（0.5～1μg/孔）；

7. 置37℃，5% CO2 培养箱中培养12-14h；

8. 甩弃上清，并用RPMI-1640培养液洗细胞1次；

9. 每孔均加入0.25%结晶紫，100μl/孔，室温下染色10min；

10. 甩弃上清，再用PBS洗板3次；

11. 室温下凉干，加入柠檬酸钠缓冲液脱色，100μl/孔；

12. 充分混匀后，用酶标仪以检测波长570nm，参考波长630nm测各孔OD值。