L929细胞增殖MTT比色法检测IL-1的生物活性
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L929 细胞增殖MTT比色法检测IL-1的生物活性
【基本原理】
IL-1具有刺激多种来源的成纤维细胞增殖的作用,可用于IL-1生物活性检测。目前国内外大多数实验室常用L929细胞株(小鼠成纤维细胞瘤细胞)作为检测IL-1生物活性的靶细胞或反应细胞。MTT比色法的原理是利用四甲基偶氮唑盐[3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下,由淡黄色被还原成蓝紫色或蓝黑色的MTT-甲肷,形成的量与活细胞代谢率及细胞增殖程度成正相关。故通过反应细胞形成的MTT-甲肷量,即可测定IL-1对L929细胞促增殖作用程度,从而间接测定IL-1的生物活性。
【材料和试剂】
(1) 已诱生的IL-1待检样品:倍比稀释成不同浓度。
(2) IL-1标准品:倍比稀释成不同浓度。
(3) L929细胞:作为反应细胞或靶细胞,存活率应>95%。
(4) 0.25%胰蛋白酶
(5) 10%FCS-RPMI-1640完全培养液
(6) MTT:用PBS稀释成5mg/ml,用0.22μm膜过滤除菌及杂质,4℃避光保存。
(7) 酸化异丙醇(含0.04mol/L HCl的异丙醇):100ml异丙醇中加入0.4ml的36% HCl即可。
(8) 96孔细胞培养板,刻度吸管,毛细吸管,加样器(头),刻度离心管,离心机,细胞计数板,倒置显微镜,5%CO2 培养箱,超净工作台,酶标测定仪,570nm与630nm滤光片。
【操作步骤】
(1) 将生长状况良好的L929细胞用0.25%胰蛋白酶消化2-3min;
(2) 将L929细胞用10%FCS-RPMI-1640培养液洗涤2次,以去除消化液及原生长培养液;
(3) 用10% FCS-RPMI-1640培养液调L929细胞浓度为2×105 /ml;
(4) 将L929细胞悬液加至96孔细胞培养板,100μl/孔;
(5) 分别加入不同倍比稀释度的IL-1标准品和待测样品于96孔细胞培养板中,100μl/孔,各设3个复孔,同时设立培养液空白对照;
(6) 置37℃,5% CO2 培养箱中培养56h;
(7) 将96孔培养板取出,各孔加入MTT,10μl/孔;
(8) 置37℃,5% CO2 培养箱中继续培养4h;
(9) 取出培养板,先从各孔中轻轻吸出100μl上清液弃去,再加入酸化异丙醇或DMSO,100μl/孔,置室温10~20min,吹打震荡,充分混匀,使MTT-甲肷产物充分溶解;
(10) 用酶标仪以检测波长570nm,参考波长630nm,分别测定各孔OD值。测定应在酸化异丙醇加入后lh内完成。
【结果分析】
(1) 每孔OD值应为OD570 nm-OD630 nm,再减去培养液对照OD值,最终每孔OD值应取3复孔的平均值;
(2) 以log2 [稀释度]为X(横座标),各稀释度对应的OD值为Y(纵座标),在普通坐标纸上,分别绘制出IL-1标准品与待测样品两条回归曲线(如图)。
IL-1标准品与待测样品两条回归曲线
(3) 经标准品最大OD值一半处(即标准品50%最大OD值处)的A点画一条平行于X轴的横线,由此产生相关于待测样品回归曲线的B点;
(4) A点与B点所对应的横轴上的值为X,因X=log2 [稀释度],则A点与B点对应的稀释度值为:稀释度=2X ,求得稀释度。
待测样品IL-1活性单位计算公式:
待测样品IL-1活性
(U/ml)
|
=
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B点对应的样品稀释度
|
×
|
标准品IL-1活性(U/ml)
|
A点对应的标准品稀释度
|
或者采用下列公式计算:
待测样品IL-1活性
(U/ml)
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=
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达标准品50%最大OD值对应的样品稀释度
|
×
|
标准品IL-1活性
(U/ml)
|
达标准品50%最大OD值对应的标准品稀释度
|
【注意事项】
(1) L929细胞存活率应>95%,L929细胞在培养条件不良时,可呈圆形漂浮状,此时更换培养液可使其恢复为正常的梭形贴壁细胞。
(2) 应充分洗涤后加入培养板中,且应均匀分散于各孔中,否则可能造成某个部位细胞过密而某个部位细胞过稀,影响细胞单层形成。
(3) 标准品及待测样品应从1:2开始至少6个倍比稀释度。
(4) 加样时,应从低浓度到高浓度顺序加入,不可共用加样器头。
(5) 加入酸化异丙醇后,应在lh内进行OD值测定。
(6) 还可按正态概率纸法或概率单位法计算IL-1的活性单位。