MTT比色法检测IL-2的生物活性
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MTT 比色法检测IL-2的生物活性
【基本原理】
IL-2的生物活性检测法是检测IL-2对靶细胞（或反应细胞）的促增殖作用的能力。IL-2反应细胞增殖程度可以增殖细胞中DNA合成或酶活性为指示系统，通过测定3 H-TdRDNA掺入量或MTT比色法OD值，并通过与标准品对照，间接测定IL-2的生物活性单位。以下三类细胞可作为IL-2的检测细胞：①IL-2依赖细胞株，如CTLL，CTLL-2，尤以后者最常用；②有丝分裂原活化的T淋巴母细胞；③小鼠胸腺细胞。下面主要介绍以CTLL-2细胞作为反应细胞检测IL-2的生物学活性，又包括MTT比色法与3 H-TdR掺入量两种基本方法，其原理参见IL-1的生物活性检测部分。
【材料和试剂】
（1） CTLL-2细胞：作为反应细胞或靶细胞。
（2） 待测样品：从1:2开始作倍比稀释，至少6个稀释度。
（3） IL-2标准品：同上作倍比稀释，至少6个不同稀释度
（4） 10% FCS-RPMI-1640完全培养液
（5） MTT：用PBS配成浓度为5mg/ml的MTT溶液，用0.22μm滤膜过滤除菌及杂质，4℃避光保存。
（6） 酸化异丙醇：100ml异丙醇中加入0.4ml 36%HCl即可成为0.04mol/L HCl的异丙醇。
（7） 96孔细胞培养板，刻度吸管、毛细吸管，加样器（头），刻度离心管，离心机，细胞计数板，倒置显微镜，超净工作台，CO2 培养箱，酶标测定仪，570nm和630nm滤光片。
【操作步骤】
（1） 用10% FCS-RPMI-1640完全培养液洗涤CTLL-2细胞2次，1000r/min离心5min，以去除原生长培养液（含有IL-2）；
（2） 用10%FCF-RPMI-RPMI-1640培养液调细胞浓度为1×105 /ml；
（3） 将不同倍比稀释度的IL-2的标准品及待测样品分别加入96孔培养板中，100μl/孔，各设3复孔，并同时设培养液对照；
（4） 各孔内均加入CTLL-2细胞悬液，100μl/孔；
（5） 置37℃，5% CO2 培养箱中培养24h（18-24h均可）；
（6） 细胞培养至18-24h时，各孔加入MTT溶液，10μl /孔继续培养4h；
（7） 取出培养板，先从各孔中轻轻吸出100μl上清液弃去。再加入酶化异丙醇或DMSO，100μl/孔，置室温10-20min，吹打震荡，充分混匀，使MTT-甲肷产物充分溶解；
（8） 用酶标仪的检测波长570nm，参考波长630nm，分别测定各孔OD值，测定应在加入酸化异丙醇后1h内完成。
【结果分析】
（1） 每孔OD值应取3复孔的平均值，最终各孔OD值应为OD570 nm-OD630 nm，再减去培养液对照孔OD值；
（2） 按概率单位分析法计算IL-2活性单位（参见IL-1的生物活性检测法部分）：样品IL-2活性单位采用下列公式计算：
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样品IL-2活性单位（U/ml）
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=
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达标准品最大OD值50%的样品稀释度
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×
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标准品IL-2活性单位
（U/ml）
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达最大OD值50%对应的标准品稀释度
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【注意事项】
（1） CTLL-2细胞存活率应＞95%（细胞折光性好，形态饱满），洗涤时操作不要太猛烈，因CTLL-2细胞膜极脆，容易破碎而影响检测结果。
（2） CTLL-2细胞要充分洗涤，因原生长培养液中含有IL-2。
（3） CTLL-2细胞对鼠IL-4亦有增殖反应，若样品中含有鼠IL-4，将影响检测结果准确性，此时可用抗鼠IL-4 McAb处理待测样品后再进行检测。但CTLL-2细胞对人IL-4无增殖反应。
（4） CTLL-2的最佳终浓度宜为1×104 /孔，且应均匀分布。
（5） CTLL-2细胞冻存后复苏较为困难，而长期培养又易产生变异而干扰IL-2活性测定，应加以注意。
（6） IL-2标准品及待测样品从1:2开始至少6个倍比稀释度，加样时应从低浓度到高浓度顺序加入，且不可共用加样器头。
（7） 加入MTT的最佳时间应为培养液对照（无IL-2）孔细胞全部死亡时，一般时间是细胞培养至18-24h时。
（8） 加入酶化异丙醇后，应在1h内进行OD测定。如果1h内无法测定，可将未加酸化异丙醇的96孔培养板暂时放入4℃冰箱保存。测定前，取出置室温下数分钟，再加入酶化异丙醇进行OD值测定。
（9） 因RPMI-1640培养液中含有的酚红可干扰OD值测定，而加入酶化后的异丙醇，可使培养液中的酚红在酸性条件下由红色变成黄色，从而可排除红色对OD值测定的干扰；此外，设立培养液对照，可进一步排除培养液对OD值测定的影响。
（10） IL-2活性单位计算方法有多种，除在IL-1活性单位计算法中所述的方法外，还可通过正态概率纸法、概率单位法计算IL-2活性单位，亦可对结果进行计算机处理，得出IL-2的活性单位。有关计算方法可参阅医学统计学的有关内容。
