3H-TdR掺入法检测IL-2的生物活性

互联网2010-12-02

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³ H-TdR 掺入法检测IL-2的生物活性

【材料和试剂】

（1）反应细胞：CTLL-2，存活率应＞95%。

（2） IL-2标准品：倍比稀释为不同浓度。

（3）待测样品：倍比稀释为不同浓度。

（4） 10% Fcs-RPMI-1640完全培养液

（5） ³ H-TdR

（6） 96孔培养板，刻度吸管，毛细吸管，刻度离心管，离心机，加样器（头），细胞计数板，倒置显微镜，超净工作台，CO₂ 培养箱，微量细胞收集仪，玻璃纤维滤纸，ß液闪计数仪。

【操作步骤】

（1）用10 %FCS-RPMI-1640培养液洗涤CTLL-2细胞2次，1000r/min离心5min，以去除原生长培养液（含IL-2）；

（2）用10% Fcs-RPMI-1640培养液调细胞浓度为1×10⁵ /ml；

（3）将不同倍比稀释度的IL-2的标准品和待测样品分别加入96孔细胞培养板，100μL/孔，各设3复孔，同时设培养液对照；

（4）各孔均加入CTLL-2细胞悬液，100μl/孔；

（5）置37℃，5%CO₂ 培养箱中培养24h；

（6）每孔均加入³ H-TdR，0.5μci/孔，继续培养4-6h；

（7）用微量细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维纸上，用ß液闪计数仪测定各孔cpm值。测定CPM值的最佳时间应是培养液对照（无IL-2）细胞全部或大部分死亡而加有IL-2孔细胞生长旺盛时。

【结果分析】

（1）每孔cpm值为了复孔的平均值，再减去培养液对照，即为各孔最终c

（2）计算IL-2活性单位（参见IL-1、IL-2的MTT比色检测法）可按下式计算：

样品IL-2活性单位（U/ml）	=	达50%最大增殖³ H-TdR渗入值的样品稀释度	×	标准品IL-2活性单位（U/ml）
达50%最大增殖³ H-TdR渗入值的标准品稀释度

【注意事项】

（1）用¹²⁵ I-UdR代替3H-TdR进行IL-2活性检测。其优点是不需ß液体闪烁测定所需的试剂和设备，只需一台小型γ计数仪即可，并可节省时间和减少ß液体闪烁操作中出现的误差。其缺点是¹²⁵ I-UdR半衰期较短，需要定期供应。基本方法同³ H-TdR掺入法，只是用¹²⁵ I-UdR代替³ H-TdR，0.2μci/孔，然后再加入1mmol/L的5-氟尿嘧啶5μl，继续培养24h，收集细胞用γ计数仪测定cpm值。

（2）其余注意事项可参见MTT法检测IL-2活性部分。