小鼠胸腺细胞增殖3H-TdR掺入法检测IL-1的生物活性
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小鼠胸腺细胞增殖3 H-TdR掺入法检测IL-1的生物活性
【基本原理】
IL-1可协同有丝分裂原(如ConA或PHA)刺激的T细胞或胸腺细胞发生增殖反应,通过3 H-TdR DNA掺入法,即可测定IL-1生物活性。此法是目前测定IL-1活性常用而简便的方法,其敏感度达10-50pg/ml。但本法缺乏特异性,因为IL-1亦可刺激T细胞或胸腺细胞产生一些细胞因子(如IL-2等),同样可协同有丝分裂原刺激细胞增殖,且在细胞增殖过程中还可受到样品中T细胞增殖抑制因子的干扰。
【材料和试剂】
(1) 小鼠:BALB/C或C57BL/6小鼠,6-10周龄,雌雄均可。
(2) 75%酒精
(3) 5% FCS-RPMI-1640完全培养液与RPMI-1640完全培养液
(4) ConA或PHA
(5) IL-1标准品:倍比稀释成至少6个不同浓度值。
(6) IL-1待测样品:倍比稀释成至少6个不同浓度值。
(7) 3 H-TdR、β-液闪汁数仪,微量细胞收集仪
(8) 解剖刀、剪、单皿、研磨工具(玻璃匀浆器,不诱钢网或者毛玻璃片,用于研磨小鼠胸腺)
(9) 96孔细胞培养板
(10) 刻度吸管,毛细吸管,刻度离心管、离心机、细胞计数板,倒置显微镜,加样器(头),50%CO2 培养箱,超净工作台
【准备工作与ConA或PHA亚适剂量的确定】
测定样品前必须作ConA或PHA的剂量曲线,观察其对小鼠胸腺细胞增殖的影响,选择一个既能够激活胸腺细胞,但又不引起其明显增殖的合适剂量,即亚适剂量。
(1) 在96孔培养板各孔中加入小鼠胸腺细胞,100μl/孔;
(2) 加入不同浓度的ConA(或PHA),100μl/孔,使其终浓度分别为0.5μg/ml,1μg/ml ,2μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,各设三复孔,以不加ConA的培养液作对照;
(3) 置37℃,5% CO2 培养箱中培养72h,收获前12h加入3 H-TdR,0.5μci/50μl/孔;
(4) 用微量细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维纸上,用β-液闪计数仪测定各孔cpm值;数据(cpm)以三个复孔平均值+ 标准差表示,
(5) 数据(cpm)以三个复孔平均值+ 标准差表示,绘制ConA剂量曲线,据此选择亚适剂量,通常为0.2-2.0μg/ml)(终浓度);
【操作步骤】
(1) 拉颈处死小鼠,浸泡于75%酒精中3-5min,消毒处理;
(2) 无菌操作取出小鼠胸腺,放入含有RPMI-1640完全培养液的平皿中;
(3) 将胸腺剪碎(或研磨工具磨碎),无菌纱布过滤,制成单个胸腺细胞悬液;
(4) 用PRMI-1640完全培养液洗涤上述细胞2次,1500r/min离心10min,然后用5% FCS-RPMI-1640完全培养液调细胞浓度为1.5×107 /ml;
(5) 在96孔培养板各孔中加入小鼠胸腺细胞,100μl/孔;
(6) 将倍比稀释后的标准品与待测样品加到上述各孔中,100μl/孔,一式3份,设培养液对照及有丝分裂原对照。
(7) 将预先确定的亚适剂量的ConA(终浓度约0.2~2.0μg/ml)或PHA(终浓度为约0.5~4.0μg/ml)加入96孔培养板中,100μl/孔。
(8) 置37℃,5% CO2 培养箱中培养72h,收集前10-12h加入3 H-TdR 0.5uci/50ul/孔。
(9) 用微量细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维纸上,用β液闪计数仪测定各孔3 H-TdR掺入量(cpm值)。
【结果分析】
(1) 各孔cpm值为3复孔平均值减去培养液对照与ConA对照(或PHA对照)3复孔平均值。
(2) 待测样品IL-1活性单位计算方法参见前述L929细胞增殖MTT比色法检测待测样品IL-1生物活性部分。
【注意事项】
(1) 所制备的小鼠胸腺细胞存活率应>95%。
(2) 标准品及待测样品应以1:2开始至少6个倍比稀释度。
(3) 加样时,应以低浓度到高浓度顺序加入,且不可共用加样器头。
(4) 由于受其他细胞因子的影响,本法特异性受到一定限制。
(1) 亦可用D10G4.1细胞(小鼠T辅助细胞克隆)代替上述小鼠胸腺细胞进行IL-1生物活性检测,基本方法相同。但由于D10G4.1细胞对IL-1的敏感性大大增强,而对IL-2相对不敏感,且对IL-1的敏感性比对IL-2的敏感性大100~1000倍,故本法敏感性与特异性均较小鼠胸腺细胞增殖法。