小鼠胸腺细胞增殖3H-TdR掺入法检测IL-1的生物活性
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小鼠胸腺细胞增殖3 H-TdR掺入法检测IL-1的生物活性
【基本原理】
IL-1可协同有丝分裂原（如ConA或PHA）刺激的T细胞或胸腺细胞发生增殖反应，通过3 H-TdR DNA掺入法，即可测定IL-1生物活性。此法是目前测定IL-1活性常用而简便的方法，其敏感度达10-50pg/ml。但本法缺乏特异性，因为IL-1亦可刺激T细胞或胸腺细胞产生一些细胞因子（如IL-2等），同样可协同有丝分裂原刺激细胞增殖，且在细胞增殖过程中还可受到样品中T细胞增殖抑制因子的干扰。
【材料和试剂】
（1） 小鼠：BALB/C或C57BL/6小鼠，6-10周龄，雌雄均可。
（2） 75%酒精
（3） 5% FCS-RPMI-1640完全培养液与RPMI-1640完全培养液
（4） ConA或PHA
（5） IL-1标准品：倍比稀释成至少6个不同浓度值。
（6） IL-1待测样品：倍比稀释成至少6个不同浓度值。
（7） 3 H-TdR、β-液闪汁数仪，微量细胞收集仪
（8） 解剖刀、剪、单皿、研磨工具（玻璃匀浆器，不诱钢网或者毛玻璃片，用于研磨小鼠胸腺）
（9） 96孔细胞培养板
（10） 刻度吸管，毛细吸管，刻度离心管、离心机、细胞计数板，倒置显微镜，加样器（头），50%CO2 培养箱，超净工作台
【准备工作与ConA或PHA亚适剂量的确定】
测定样品前必须作ConA或PHA的剂量曲线，观察其对小鼠胸腺细胞增殖的影响，选择一个既能够激活胸腺细胞，但又不引起其明显增殖的合适剂量，即亚适剂量。
（1） 在96孔培养板各孔中加入小鼠胸腺细胞，100μl/孔；
（2） 加入不同浓度的ConA（或PHA），100μl/孔，使其终浓度分别为0.5μg/ml，1μg/ml ，2μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，各设三复孔，以不加ConA的培养液作对照；
（3） 置37℃，5% CO2 培养箱中培养72h，收获前12h加入3 H-TdR，0.5μci/50μl/孔；
（4） 用微量细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维纸上，用β-液闪计数仪测定各孔cpm值；数据（cpm）以三个复孔平均值+ 标准差表示，
（5） 数据（cpm）以三个复孔平均值+ 标准差表示，绘制ConA剂量曲线，据此选择亚适剂量，通常为0.2-2.0μg/ml）(终浓度)；
【操作步骤】
（1） 拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中3-5min，消毒处理；
（2） 无菌操作取出小鼠胸腺，放入含有RPMI-1640完全培养液的平皿中；
（3） 将胸腺剪碎（或研磨工具磨碎），无菌纱布过滤，制成单个胸腺细胞悬液；
（4） 用PRMI-1640完全培养液洗涤上述细胞2次，1500r/min离心10min，然后用5% FCS-RPMI-1640完全培养液调细胞浓度为1.5×107 /ml；
（5） 在96孔培养板各孔中加入小鼠胸腺细胞，100μl/孔；
（6） 将倍比稀释后的标准品与待测样品加到上述各孔中，100μl/孔，一式3份，设培养液对照及有丝分裂原对照。
（7） 将预先确定的亚适剂量的ConA（终浓度约0.2~2.0μg/ml）或PHA（终浓度为约0.5~4.0μg/ml）加入96孔培养板中，100μl/孔。
（8） 置37℃，5% CO2 培养箱中培养72h，收集前10-12h加入3 H-TdR 0.5uci/50ul/孔。
（9） 用微量细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维纸上，用β液闪计数仪测定各孔3 H-TdR掺入量（cpm值）。
【结果分析】
（1） 各孔cpm值为3复孔平均值减去培养液对照与ConA对照（或PHA对照）3复孔平均值。
（2） 待测样品IL-1活性单位计算方法参见前述L929细胞增殖MTT比色法检测待测样品IL-1生物活性部分。
【注意事项】
（1） 所制备的小鼠胸腺细胞存活率应>95%。
（2） 标准品及待测样品应以1:2开始至少6个倍比稀释度。
（3） 加样时，应以低浓度到高浓度顺序加入，且不可共用加样器头。
（4） 由于受其他细胞因子的影响，本法特异性受到一定限制。
（1） 亦可用D10G4.1细胞（小鼠T辅助细胞克隆）代替上述小鼠胸腺细胞进行IL-1生物活性检测，基本方法相同。但由于D10G4.1细胞对IL-1的敏感性大大增强，而对IL-2相对不敏感，且对IL-1的敏感性比对IL-2的敏感性大100~1000倍，故本法敏感性与特异性均较小鼠胸腺细胞增殖法。
