细胞增殖检测：3H-TdR渗入法实例

互联网2008-07-28

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一、原理

T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA），抗CD2、抗CD3McAb作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体（SAC）、脂多糖（LPS，对小鼠有作用）则刺激B细胞发生增殖；美洲商陆（PWM）、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。

最近发现，integrin家族中VLA组中某些受体与相应配体结合后也能活化T细胞。根据形态学或氚标记胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入率测定T细胞的增殖水平。

二、仪器、材料及试剂

1、Beckman LS-9800型液体闪烁计数仪，或Beckman LS 6500型液体闪烁计数仪。

2、多头细胞收集仪。

3、3H-TdR（比活性为2Mci~10Mci/mg分子）。3H-TdR工作液：将1Mci/ml溶液以生理盐水稀释成100μci/ml，于4℃保存备用。临用时再用培养液稀释成10μci/ml溶液。3H-TdR一般临用时稀释。

4、闪烁液：PPO（2，5-二苯基恶唑）、POPOP（1，4-双-2-15-苯基恶唑苯）Sigma公司。ppo5.0g popop0.1～0.3g 加二甲苯或甲苯至1L；POPOP加入少量二甲苯在37℃水浴上溶解后，再加PPO，然后补足二甲苯。配好的闪烁液需要闭光。闪烁液配制和检测的样品有关：

5、其他：5%三氯醋酸；3%冰醋酸；浓甲醛；30%H2O2液

三、操作步骤

1、分离淋巴细胞（可来自外周血，脾细胞等）

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2、洗涤后用10%FCS RPMI1640调整合适的细胞数（2×106／ml）

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3、加入96孔培养板中，2×105细胞／100μl／孔，每组设3孔

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4、加入最适剂量PHA或Con A，100μl／孔，同时设不加PHA或Con A阴性对照，一般每孔最终体积为200μl（细胞终浓度1×105）

　　　　↓　37℃、5% CO2孵育，66h（20h后加药处理）

5、每孔加入0.5～1μci　3H-TdR（50μl）

　　　　↓　继续培养6～12h

6、培养结束后，离心吸去上清液，用200μl 冷PBS洗涤二次（2000r/min离心10min）用冷PBS可以终止反应

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7、用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品，于"9999"型玻璃纤维滤纸（膜）上。抽洗至少2次。

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8、取出滤膜，排列好，置于干燥箱中，60℃~80℃，30min烘干（75℃烤箱过夜）。对号剪下各个滤膜片，然后将滤膜放入装有5ml的闪烁液中（贴细胞的面朝上）。闪烁瓶暗处放置15min。

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9、β液闪仪（Beckman LS-9800型液体闪烁计数仪）计数（测定放射性cpm值）。

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10、计算结果

①增殖水平直接用每分的脉冲数cpm值表示，再按标本淋巴细胞计数结果，校正成每百万淋巴细胞的脉冲数（cpm/106淋巴细胞）。取各管测定数的平均值。

②也可用刺激指数（SI）表示试验结果

Con A/PHA（或实验组）cpm－机器本底

SI＝───────────────────────────────

阴性对照组（不加Con A/PHA）cpm－机器本底

以SI表示结果时，一定要设置相同数量培养孔的对照（即不加Con A/PHA）。而以cpm绝对值表示（cpm/106淋巴细胞）则可以不用设对照管。因为对照的cpm与本底比较接近，不同样品之间的少许差别也不易确定其意义。

四、注意事项

1、采用手工裁剪大小合适的玻璃纤维膜（Wallac公司）。废液瓶和真空泵之间最好加一个缓冲瓶，不要直接将真空泵上的橡胶管连接到废液瓶上，以免万一含3H（氚）的废液进入橡胶管。

2、3ml 5%三氯乙酸固定、5 ml无水乙醇脱水（脱水后滤膜明显变白）。闪烁液的容水量很低，所以在加入闪烁液之前必须烘干。但加入一定量的醇类（如无水乙醇），则可容纳少量的处理后所残留的水分，但也仍需烘至接近干燥的程度，否则将发生浑浊而无法测定。据报道，如果闪烁液中加入1/3的异辛基苯氧聚乙氧乙醇（TritonX-100），其容水量可达15%，消化溶解后的样品，不必烘干，即可添加闪烁液测定。

3、PHA、ConA、LPS等在正式实验前均需摸索最适剂量或亚适剂量。厂家和批号不同丝裂原作用常有很大差别。根据实验需要，对不同种（人、小鼠、大鼠、兔、狗等）不同来源淋巴细胞（胸腺、脾脏、淋巴结、扁桃腺、外周血等）均应进行最适细胞浓度、培养时间和刺激物浓度的摸索。

五、单位换算

Curies 和 d . p . m 的换算：

Curies 和 Becquerels的换算：

1 Curie （Ci） =2.22×1012 d . p . m .

1 milliCurie （mCi） =2.22×109 d . p . m .

1 microCurie （m Ci） =2.22×106 d . p . m .

1 nanoCurie （nCi） = 2.22×103 d . p . m .

1 picoCurie （pCi） =2.22 d . p . m .

1 Ci = 3.7×1010 Bq =37GBq （gigaBq）

1 mCi = 3.7×10 7 Bq =37MBq （megaBq）

1 m Ci = 3.7×10 4 Bq =37kBq （kiloBq）

1 GBq =2.7×10 -4 Ci =27.027mCi（milliCi）

1 MBq =2.7×10 -7 Ci =27.027m Ci（nanoCi）

1 kBq =2.7×10-10 Ci =27.027nCi （nanoCi）