BrdU渗入法

细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。

 

单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

 

BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

一、试剂配制

1.  BrdU配制

BrdU 10 mg加双蒸水10 ml ，4℃下避光保存。

2.  2xSSC配制

NaCl 1.75 g，柠檬酸三钠0.88 g，加水至100 ml，4℃保存。

二、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10 ug/ml。

 

三、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1 ug。

 

四、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

 

五、常规染色体制片。

 

六、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2xSSC 液，距紫外灯管6 cm处紫外照射30分钟。

 

七、弃去2xSSC液，流水冲洗。

 

八、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。

 

九、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

 

十、计算

 

细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小时）

 

 

一、细胞周期介绍

细胞周期（cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期两个阶段 。

 

1.  间期

 

间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。

 

（1）G1期　　

此期长短因细胞而异。体内大部分细胞在完成上一次分裂后，分化并执行各自功能，此G1期的早期阶段特称G0期。在G1期的晚期阶段，细胞开始为下一次分裂合成DNA所需的前体物质、能量和酶类等。

 

（2）S期　　

S期是细胞周期的关键时刻，DNA经过复制而含量增加一倍，使体细胞成为4倍体，每条染色质丝都转变为由着丝点相连接的两条染色质丝。与此同时，还合成组蛋白，进行中心粒复制。S期一般需几个小时。

 

（3）G2期　　

为分裂期做最后准备。中心粒已复制完毕，形成两个中心体，还合成RNA和微管蛋白等。G2期比较恒定，需用1～1.5小时。

 

2.  分裂期

 

细胞的有丝分裂（mitosis）需经前、中、后，末期，是一个连续变化过程，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1～2小时。

 

（1）.前期（prophase）染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体（chromosome）。染色体短而粗，强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极；而后以中心粒随体为起始点开始合成微管，形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。

 

（2）中期（metaphase）细胞变为球形，核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群，共46个,其中44个为常染色体,2个为性染色体。男性的染色体组型为46,XY，女性为46XX。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状，均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。

 

（3）后期（anaphase）由于纺锤体微管的活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动，接近各自的中心体，染色单体遂分为两组。与此同时，细胞波拉长，并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑铃形。

 

（4）末期（telophase）染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁；内质网囊泡组合为核被膜；组胞赤道部缩窄加深，最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。

 

在体内根据细胞的分裂能力可把它们分为三类：

①增殖细胞群，如造血干细胞，表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。这类细胞始终保持活跃的分裂能力，连续进入细胞周期循环。

②不再增殖细胞群，如成熟的红细胞、神经细胞、心肌细胞等高度分化的细胞，它们丧失了分裂能力，又称终末细胞（end cell）。

③暂不增殖细胞群，如肝细胞、肾小管上皮细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的，并执行特定功能的细胞，在通常情况下处于G0期，故又称G0期细胞。在某种刺激下，这些细胞重新进入细胞周期。如肝部分切除术后，剩余的肝细胞迅速分裂。