流式细胞仪测定法
最新修订时间：
原理
一、取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800 rpm，离心 15 min 去上清。
二、PBS 洗 2 次，加 0.5 mL PBS 吹匀，务必吹散。
三、用 5 mL 注射器将细胞吸起，用力打入 5 mL 70%（预冷）乙醇中，封口膜封口。4℃ 固定过夜（可长至 2 周）。
四、800 rpm 15 min 收集固定细胞，PBS 洗 2 次。
五、用 0.4 mL PBS 重悬细胞并转至 Tube 中轻轻吹打（防止细胞破碎）。
六、加 RNase-A 约 3 uL 至终浓度约为 50 ug/mL ，37℃ 水浴消化 30 min。
七、加 PI 约 50 uL 至终浓度约为 65 ug/mL ，在冰浴中避光染色 30 min。
八、用 300 目（孔径 40~50 微米）尼龙网过滤，上机检测。
九、样品分析测定及打印。
材料与仪器
HeLa 细胞；
乙醇、RNase-A、PI、PBS；
流式细胞仪、细胞培养设备、离心机、水浴、冰箱、注射器、离心管、封口膜、微量移液器；
步骤
一、取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800 rpm，离心 15 min 去上清。
二、PBS 洗 2 次，加 0.5 mL PBS 吹匀，务必吹散。
三、用 5 mL 注射器将细胞吸起，用力打入 5 mL 70%（预冷）乙醇中，封口膜封口。4℃ 固定过夜（可长至 2 周）。
四、800 rpm 15 min 收集固定细胞，PBS 洗 2 次。
五、用 0.4 mL PBS 重悬细胞并转至 Tube 中轻轻吹打（防止细胞破碎）。
六、加 RNase-A 约 3 uL 至终浓度约为 50 ug/mL ，37℃ 水浴消化 30 min。
七、加 PI 约 50 uL 至终浓度约为 65 ug/mL ，在冰浴中避光染色 30 min。
八、用 300 目（孔径 40~50 微米）尼龙网过滤，上机检测。
九、样品分析测定及打印。
常见问题
一、常见问题
1. Q：要做胃粘膜组织的 DNA 含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？
1. Q：要做胃粘膜组织的 DNA 含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？
A：我做过乳腺细胞的 DNA 含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加 70% 冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为 50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存 12 小时，最多可保存一个月，上机检测前再加 PI 综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为 5%。
2. 实验中想用 PI 分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题：
Q：（1）所用的 RNAs 酶用什么配制呢？用 PBS 配吗？
A：RNaseA 用 PBS 配制没有问题，但是注意要沸水浴去除 DNase 的活性。
Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用 RNAs 酶，可以一起检测吗？
A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。
Q：（3）Triton－x－100 是固定剂吧，用了 70％ 的冷乙醇（是4℃ 吗？），是不是就不用 Triton－x－100 固定了？
A：Triton X-100 是起透化作用的，不是固定剂，可以用 75％ 的乙醇于 -20℃ 固定。
Q：（4）还要设什么内参标准（5％ 鸡红细胞）吗？
A：对照肯定是需要的，这个根据自己的需要进行设置。
Q：（5）不用试剂盒行不行啊？
A：完全可以不用试剂盒。
以下提供一个自己的实验步骤供参考：
（1）200xg 离心 10 min 收集细胞；
（2）弃去上清，PBS 漂洗一次，将细胞重悬于预冷的 80% 乙醇中，-20℃ 固定 24 h 以上；
（3）进行流式细胞仪检测前，200xg 离心 10 min 收集固定后的细胞；
（4）PBS 洗涤一次，200xg 离心 10 min 收集细胞；
（5）将细胞重悬于含 100 ug/ml RNase A 和 50 ug/ml PI 的 PBS 中，室温孵育 30 min；
（6）将经 PI 染色和 RNase A 消化后的细胞悬液用 300 目的尼龙膜过滤后即可利用流式细胞仪进行细胞周期分布和凋亡细胞定量的分析。
3. Q：流式检测细胞周期时加 RNA 酶所需的温度？
A：其实有关 RNA 酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见，该观点的人认为 RNA 酶在环境中无所不在，常规制样过程中所接触的试剂和环境中的 RNA 酶已足以降解样品中的 RNA，所以为了简便实验操作，也有人不加 RNA 酶或如你所参考的方法将其与 PI 染液一起使用。不过经典的方法还是先加 RNA 酶 37℃ 孵育 30 min，然后加 PI 4℃ 孵育 30 min。
至于染色时使用 4℃，是因为低温可减弱分子运动，增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。
4. Q：我养肿瘤细胞，测周期。看到帖子说 70％ 乙醇必须用 PBS 和乙醇配，用水配细胞会碎裂，有帖子说 PBS 和乙醇配会出现絮状物。上流式前细胞用 75％ 乙醇固定，就用买来的现成的瓶装 75％ 乙醇，行吗？必须那么严格吗？
A：先用冷 PBS 悬浮细胞，大约 1-2ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为 70-75% 乙醇。不直接加 75% 乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。
5. Q：我要做流式分析细胞周期，我大概收集了 106 细胞，但细胞在乙醇固定之后，还看到有细胞沉淀的，但 PBS 洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机发现就发现不了细胞了。这是怎么回事啊？怎么解决这个问题啊？
A：很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有：
（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机
（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留 1 mm 左右的水膜，不要吸完。
（3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿
（4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。
来源：丁香实验
