细胞计数法（细胞周期测定实验）

体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。

分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。

器材：

Giemsa 染液、CO₂ 培养箱、普通显微镜

培养皿、盖玻片、吸管

试剂：

细胞样品、胰酶、甲醇、培养液、冰醋酸

(1) 消化细胞：在 37 ℃ 下，将旧培养基中的培养液吸出后加入 PBS 清洗 1 次。再加入能够略盖住细胞的胰蛋白酶液，30s~2 min 后吸去。注意消化时间，过短或过长均不可。

显微镜下观察，看到细胞回缩，或细胞呈半沙状移动，或用移液枪可吹打下来即可。加入新鲜培养液，将细胞吹打下来，收集细胞悬液。并将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。

(2) CO₂ 培养箱中培养 48 小时，使细胞长在盖片上。

(3) 取出盖片，按下列顺序操作：PBS 漂洗 3 分钟 → 甲醇：冰醋酸 = 3:1 固定液中固定 30 分钟 → Giemsa 液染色 10 分钟 → 自来水冲洗。 

(4) 盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。 

(5) 计算：分裂指数 = 分裂细胞数 / 总细胞数 × 100%

Giemsa 染液配制

称 Giemsa 粉末 0.5 g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为 33 ml）。56 ℃ 中保温 90～120 分钟。加入 33 ml 甲醇，置棕色瓶中保存，此为 Giemsa 原液。使用时按要求用 PBS 稀释。一般稀释 10 倍。