流式细胞仪测定细胞活性氧实验

活性氧检测试剂盒（Reactive oxygen species assay kit）是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物（compound mixture），浓度为50mg/ml。

一、注意事项

1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。

3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

二、使用说明

1、装载探针

对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激

时间较长（通常为6小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA的体积为1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。

收集细胞后装载探针：按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性

根据文献《流式细胞术检测细胞内活性氧的方法》

阳性对照组为 (双氢罗丹明DHR 1μmol/L及H2O250μmol/L共同孵育1h)

以1μmol/L DHR孵育细胞1、6、24h, 同时设立空白对照 (不加DHR) 及阳性对照 (DHR 1μmol/L及H2O250μmol/L共同孵育1h) 。

没有做阳参，阴参之外的都认为是阳的，你最好买个大公司的kit，要不有的做不出来