Hoechst/PI双标记法检测细胞凋亡
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Hoechst/PI 双标记法检测细胞凋亡
凋亡细胞在等渗条件下进行活细胞染色,其吸收Hoechst的能力增强。因此,在活细胞中加入Hoechst染料,凋亡细胞很快产生较强的蓝色荧光,其强度要比坏死的和活的细胞大得多。Hoechst/PI双标记法是目前细胞凋亡最满意的形态学分析方法。先用Hoechst进行活细胞染色,再进行PI染色,并与细胞光散射性质测定结合起来。Hoechst/PI双标记法也适用于不发生DNA断裂的凋亡细胞的测定。
【材料与试剂】
Hoechst 33342储存液(0.1mg/ml):配制方法同上述。
PI储存液(1mg/ml):配制方法同上述。
PBS
培养细胞或离体细胞制成的单细胞悬液。
【操作方法】
将106 个细胞悬浮于1ml培养基(含10%小牛血清)中,加入10μl Hoechst33342储存液,混匀;
置于37℃温育5~15min;
将细胞置于冰上冷却后,于4℃离心,去除上清;
将细胞重新悬浮于1ml PBS中,加入5μl PI储存液,混匀,37℃复染10~15min;
PBS洗涤,用荧光显微镜观察分析;
【结果判断】
在荧光显微镜下观察,凋亡细胞的蓝色荧光比活细胞和非凋亡细胞都要强,其光散射能力则降低,将二者结合起来,可以很好地鉴定凋亡细胞。坏死细胞则由于PI复染,呈红色荧光。