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流式细胞仪对疟疾入侵的分型检测

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实验步骤

 

标记目标红细胞:

根据选择的DNA染料选择对目标红细胞的荧光标记,这本身就取决于流式细胞仪在入侵检测分析结束时获得的数据,CFDA SE的荧光发射峰约为517nm,接近520nm处SYBR Green I的荧光。CFDASE可以与Hoechst 33342组合使用,DDAO SE 的荧光发射峰接近657nm。因此,它可以与Hoechst 33342或SYBR Green I组合使用。

1.加入12mL RPMI 1640和0.5mL水洗红细胞到50mL管中轻轻混匀,获得2%比容的血细胞和。

2.将3mL 2%比容红细胞悬浮液转移到15mL标有“染色红细胞 ”的管中,离心3分钟。

3.吸取并弃掉离心管的上清液。

4.加入3.1mL 的RPMI 1640到15mL标有“CFDA的”管(或“DDAO”)。

5.加入12.4μL含5mM CFDA SE的二甲基亚砜(或6.2μL5mM DDAO SE的二甲基亚砜)至“CFDA” 管(或“DDAO”)获得20μM混悬溶液(或10μM),然后混合。

6.加入3 mL 20μMCFDA SE(或10μM DDAO SE)至“染色红细胞 ”管,并立即上下吹吸使得溶液混合。

7.将试管放置在震荡仪上,旋转开关,以最大的速度在37°C培育2h。

8.离心“染色红细胞”管3分钟。

9.吸取并弃掉所有上清液。

10.加入3 mL完全培养基和悬浮细胞沉淀。

11.离心3分钟。

12.吸取并弃掉所有上清液。

13.加入3 mL完全培养基和悬浮细胞沉淀。

14.将试管放置在震荡仪上,旋转开关,以最大的速度在37°C培育2h。

15.离心3分钟。

16.吸取并弃掉所有上清液。

17.加入3 mL完全培养基和悬浮细胞沉淀。

18.离心3分钟。

19.重复步骤16至18一次。

20.吸取并弃掉所有上清液。

21.加入3 mL不完全培养基,并吸取和悬浮细胞沉淀。
 

酶法处理:

1.从“染色红细胞”试管中吸取400μL细胞悬液转移到标记“A”到“F”的离心管中。

2.加入含1U/mL神经氨酸苷酶的RPMI 1640 溶液8μL管B和管E 。

3.将6个试管放置在震荡仪上,旋转开关,以最大的速度在37°C培育1h。

4.用台式微量离心机离心试管。

5.吸出并丢弃上清。

6.加入400μL不完全培养基至6个试管中用台式微量离心机离心30s。

7.吸出并丢弃所有管中的上清。

8.加入400μL不完全培养基至6个试管中悬浮沉淀。

9.加入2μL 10mg/ml蛋白酶0至C试管,加入40μL 10mg/ml蛋白酶至D、E试管,40μL 10mg/ml的糜蛋白酶至管F。

10.将6个试管放置在震荡仪上,旋转开关,以最大的速度在37°C培育1h。

11.将6个试管用台式微量离心机离心30s。

12.吸出并丢弃上清液。

13.加入400μL不完全培养基至6个试管中用台式微量离心机离心30s。

14.重复步骤12和13一次。

15.吸出并丢弃上清液。

16.加入400μL不完全培养基,吹打细胞,悬浮颗粒。
 

标记培养板和培养:

1.在96孔板盖子的顶部标记18个孔从A至E和1至3 。

2.加入大约200μL PBS至78个未标记的孔中。

3.加入50μL donor pRBC至2%比容,1-2%的原虫血症至18孔标记的细胞板,并标记为A1至F3。

4.旋转板180度。

5.加入50μL 目标红细胞至2%比容至相应的孔。(如从离心管中吸取50μL到每个孔A1,A2和A3)6.小心翼翼地取向上和向下吹吸18孔的混合溶液,避免气泡。

6.将培养板放入培养箱,37°C预热。

7.取出培养板,加入1%O2 ,3%二氧化碳平衡氮气3分钟。

8.将板放入培养箱,在37°C孵育48小时。
 

寄生虫染色:

如果目标红细胞用CFDA SE进行染色,寄生虫染色必须用Hoechst 33342。如果目标红细胞染色用DDAO SE,根据流式细胞仪上的激光线,染色寄生虫可用Hoechst 33342或SYBR Green 1 。

下面是SYBR Green I染色的过程:

1.离心3分钟。

2.吸取并弃掉18孔50μL 培养上清液并标记为A1至F3。

3.在18孔中加入200μL的PBS并离心3分钟。

4.吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。

5.加入200μL含 2%paraformaldehyde/0.2%戊二醛的PBS,重悬浮细胞沉淀,在4℃的孵育1h 。6.离心3分。重悬浮细胞沉淀。

6.吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。

7.18孔每孔加入200μL的PBS并离心3分钟。

8.吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。

9.18孔,每孔加入200μL含0.3%Triton X-100 的PBS,重悬浮细胞沉淀,室温孵育10分钟。11.离心3分钟。

10.吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。

11.18孔每孔加入200μL的PBS并离心3分钟。

12.吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。

13.18孔,每孔加入200μL含0.5mg/ml核糖核酸的PBS,重悬浮细胞沉淀,37°C孵育1h。16℃离心3分钟。

14.吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。

15.加入200μL的PBS离心3分钟。

16.吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。

17.18孔,每孔加入200μL 1:5,000的 SYBR Green I,重悬浮细胞沉淀,37°C孵育1小时。

18. 离心3分钟。

19.吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。

20.加入200μL的PBS离心3分钟。

21.重复步骤22和23两次以上。

22.吸取并弃掉18孔200μL 培养上清液。

23.18孔,每孔加入200μL PBS,重悬浮细胞颗粒。
 

流式细胞仪测试:

1. 96孔板在平底板上的盖子上标记18孔,从A1到F3。

2.18孔,每孔加入250μL PBS。

3.从18孔中吸取25μL染色细胞进行入侵检测,再把它加入新的培养板中只包含PBS。

4.吹吸混合,稀释细胞悬液。

5.采集能在流式细胞仪上产生适当激光线的稀释的细胞悬液,进行荧光标记和DNA染料选择(获得10万事件最低得到50000靶细胞进行分析)。

 

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