材料与仪器
器材:
① 80 μm 尼龙筛网
② 流式细胞仪
③ 恒温水浴锅
④ 离心机等。
试剂:
① 胶原酶
② 胰蛋白酶
③ 胰酶大豆抑制剂
④ 胃蛋白酶
⑤ 碘化丙啶
⑥ RNA 酶
⑦ Tween-20
步骤
流式细胞仪检测睾丸细胞悬液 DNA 含量的基本过程如下:
1、首先制备睾丸组织单细胞悬液:移开睾丸白膜,剪碎输精小管,用含有 0.5% 胶原酶的 PBS 在 37 ℃ 恒温水浴箱中孵育 15 分钟以释放睾丸细胞。
2、轻轻吸取剪碎的组织,PBS 洗涤细胞,800 g 离心沉降 10 分钟。用含 1.0 μg/mL 胰蛋白酶的 PBS 重新悬浮细胞。37 ℃ 再次孵育 15 分钟。
3、加入同体积的胰酶大豆抑制剂,用塑料移液管轻轻反复吸取混匀悬液 3~5 分钟,80 μm 尼龙筛网过滤。
4、滤液离心后去上清,PBS 洗涤,再次离心,取沉淀,70% 冷乙醇固定,4 ℃ 保存进行进一步分析。
5、就 DNA 含量分析而言,1x106 细胞用 PBS 洗涤 2 次,500 μL 0.2% 胃蛋白酶 37 ℃ 孵育 10 分钟。
6、离心后,细胞用含 25 μg/mL 碘化丙啶(propidium iodide,PI),40 μg/mL RNA 酶和 0.3% Tween-20 的 PBS 染液常温避光染色 20 分钟。染色后的细胞用 FACScan 流式细胞仪检测。
7、实验完毕后,用 SPSS13.0 软件分析实验结果。结果示例如图 8-6-10 所示。
注意事项
流式细胞仪检测睾丸细胞悬液 DNA 含量的关键在于单细胞悬液的制备。
来源:丁香实验