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流式细胞仪检测睾丸细胞悬液 DNA 含量

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最新修订时间:

材料与仪器

器材:

 

① 80 μm 尼龙筛网

 

② 流式细胞仪

 

③ 恒温水浴锅

 

④ 离心机等。

 
试剂:
 
① 胶原酶
 
② 胰蛋白酶
 
③ 胰酶大豆抑制剂
 
④ 胃蛋白酶
 
⑤ 碘化丙啶
 
⑥ RNA 酶
 
⑦ Tween-20

步骤

流式细胞仪检测睾丸细胞悬液 DNA 含量的基本过程如下:

 

1、首先制备睾丸组织单细胞悬液:移开睾丸白膜,剪碎输精小管,用含有 0.5% 胶原酶的 PBS 在 37 ℃ 恒温水浴箱中孵育 15 分钟以释放睾丸细胞。

 

2、轻轻吸取剪碎的组织,PBS 洗涤细胞,800 g 离心沉降 10 分钟。用含 1.0 μg/mL 胰蛋白酶的 PBS 重新悬浮细胞。37 ℃ 再次孵育 15 分钟。

 

3、加入同体积的胰酶大豆抑制剂,用塑料移液管轻轻反复吸取混匀悬液 3~5 分钟,80 μm 尼龙筛网过滤。

 

4、滤液离心后去上清,PBS 洗涤,再次离心,取沉淀,70% 冷乙醇固定,4 ℃ 保存进行进一步分析。

 

5、就 DNA 含量分析而言,1x106 细胞用 PBS 洗涤 2 次,500 μL 0.2% 胃蛋白酶 37 ℃ 孵育 10 分钟。

 

6、离心后,细胞用含 25 μg/mL 碘化丙啶(propidium iodide,PI),40 μg/mL RNA 酶和 0.3% Tween-20 的 PBS 染液常温避光染色 20 分钟。染色后的细胞用 FACScan 流式细胞仪检测。

 

7、实验完毕后,用 SPSS13.0 软件分析实验结果。结果示例如图 8-6-10 所示。

 

注意事项

流式细胞仪检测睾丸细胞悬液 DNA 含量的关键在于单细胞悬液的制备。

来源:丁香实验

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