简介
附睾精子评估实验包括：① 血细胞计数板计数整个附睾的精子数目；② 附睾精子涂片；③ CASA 仪器检测附睾尾部精子的各项运动指标；④ CTC 精子染色。
材料与仪器
器材：
①血细胞计数板
②M2 培养液
③光学显微镜
④计算机辅助精子分析仪（即 CASA：computer-assisted spermanalyzer）。
试剂：
①mHTF；
②FBS；
③1x PBS；
④精液涂片固定液。
步骤
附睾精子评估实验的基本过程可分为如下几步：
（一）血细胞计数板计数附睾精子总数操作步骤：
A 解剖 12 周龄实验组和对照组雄性小鼠各 12 只，把分离出的附睾置于 1 mL 的 M2 培养液中剪碎，37 ℃ 孵育 30 分钟，以便精子在培养液中得以释放。
B 取一滴精子悬液滴在血细胞计数板上，按照血细胞计数法测定精子悬液中的精子密度，换算为每个附睾中的精子总数，试验用相衬光学倒置显微镜观察。计数 3 次，取平均值。
C 实验完毕后，用 SPSS13.0 软件分析实验结果。
（二）附睾精子涂片观测精子形态操作步骤：
A 解剖 12 周龄实验组和对照组雄性小鼠各 12 只，把分离出的附睾置于 1 mL 的 M2 培养液中剪碎，37 ℃ 孵育 30 分钟，以便精子在培养液中得以释放。
B 另外，吸取上述精子悬液 30 μL 滴在载玻片上，用盖玻片与载玻片呈 45° 夹角迅速推膜，制成精液涂片，然后水平放置精液涂片 10 分钟。
C 晾干后浸入 95％ 乙醇与甲醇混合液中固定 2～3 分钟，取出后再次晾干。
D 常规 HE 染色后，用磷酸缓冲液（磷酸二氢钾 6.63 g，磷酸氢二钠 2.56 g，加蒸馏水至 1 L）或蒸馏水轻轻冲洗精液涂片，并不时镜检调色，至颜色合适为止，相差显微镜及高倍显微镜下观察精子形态。
（三）CASA 分析附睾尾部精子各项运动指标操作步骤：
A 将胎牛血清 FBS 和 mHTF 按体积比 1:9 制成混合液，调节 pH 至 7.8。
B 解剖 12 周龄实验组和对照组雄性小鼠各 12 只，取附睾尾部精子，加入上述 FBS/mHTF 混合液 500 μL，37 ℃，5 分钟。
C 取 10 μL 样品，用 CASA 检测分析附睾精子轨迹速度（VCL）、平均路径速度（VAP）、直线运动速度（VSL）、直线性（LIN）、精子侧摆幅度（ALH）、前向性（STR）、摆动性（WOB）、鞭打频率（BCF）、平均移动角度（MAD）、运动精子密度等相关指标，记录数据。
D 实验完毕后，用 SPSS13.0 软件分析实验结果。
（四）附睾尾部 CTC 精子染色操作步骤：
A 将胎牛血清 FBS 和 mHTF 按体积比 1:9 制成混合液，调节 pH 至 7.8。
B 解剖 12 周龄实验组和对照组雄性小鼠各 12 只，取附睾尾部精子，加入上述 FBS/mHTF 混合液 500 uL，37 ℃，5 分钟。
C 配 CTC 染液：TN 混合液 10 mL、半胱氨酸 8.8 mg、CTC 1.3 mg 混匀振荡溶解后，用 NaOH 调节 pH 至 7.4。4 ℃ 避光保存。
D 配固定液：Tris 3.02 g 溶于 10 mL PBS，10％ 甲醛 1 mL 溶于 9 mL PBS，混匀，4℃ 避光保存。
E 吸取 50 μL 精子悬液加入 50 μL CTC 染色液，反应 30 秒后，马上加入 17.5 μL 固定液轻微吹打均匀后，37 ℃ 条件下用 5％ CO2 孵育 1 小时。
F 4 ℃ 冰箱沉降过夜。
G 次日弃少许上清后吹打均匀，涂载玻片，晾干后 DABCO 封片，荧光显微镜蓝光激发观察。
H 实验完毕后，用 SPSS13.0 软件分析实验结果。
注意事项
1 附睾精子评估一般选用 12 周龄小鼠，实验组和对照组各 12 只。注意：血细胞计数法计数附睾尾部精子和附睾精子涂片通常取整个附睾，而用 CASA 仪分析附睾尾部精子各项运动指标以及 CTC 精子染色所用的往往是附睾尾部的精子，而不是整个附睾部的精子。见图 8-6-7（箭头所指处即附睾尾部）及图 8-6-8（箭头所指处即附睾尾部）。
来源：丁香实验
